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醇腈酶文献资料
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拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的表达优化及酶学性质分析
[目的]优化重组醇腈酶在大肠杆菌(Escherichia coli)中的表达工艺,考察其酶学性质.[方法]基于密码子的偏好性,对拟南芥(Arabidopsis thaliana)醇腈酶基因进行密码子优化,克隆该基因到表达载体pET-28a(+)上,构建重组质粒pET-28a(+)-HNL-At.采用单因素法优化表达工艺,Ni柱亲和层析纯化目的蛋白,紫外荧光光度法考察酶学性质.[结果]通过IPTG诱导成功实现来源于拟南芥醇腈酶基因在大肠杆菌中的重组表达,对诱导条件优化后,发酵液中重组酶活力达到29.3U·mL-1,较未优化前提高68%.通过Ni柱亲和层析对目的蛋白进行纯化,经SDS-PAGE分析重组醇腈酶相对分子质量约为30kDa.通过酶学性质分析,适反应pH为5,适反应温度为30℃,比酶活为213.9U·mg-1.[结论]实现重组醇腈酶在大肠杆菌中的高效表达,优化工艺简单可行,酶学性质表征正确,为进一步的酶法制备手性氰醇类化合物奠定基础.
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木薯醇腈酶cDNA的克隆及其表达载体的构建
目的 克隆木薯醇腈酶(HNL) cDNA构建表达载体,以实现木薯醇腈酶基因的高效表达.方法 运用 RT-PCR从木薯幼叶组织中扩增出HNL全长cDNA序列,将其克隆至质粒pBluescript SK中进行序列分析,再利用PCR将其再克隆到酵母表达质粒pPIC3.5K上.结果 经测序分析表明,克隆的cDNA片段和文献报道的4个木薯HNL cDNA 相比,核苷酸同源性高为99.1%,氨基酸同源性高为98.8%.结论 经双酶切鉴定的结果表明重组表达载体的表达载体构建成功.
