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人PD-1基因克隆及其在L929基因转染细胞上的表达
目的克隆人PD-1基因,构建含有该目的基因的重组逆转录病毒载体,并转染入L929细胞,获得稳定高表达PD-1分子的L929细胞.方法用PCR法从pGEX-5X-3-PD-1扩增出PD-1基因,通过双酶切(PstI BamHI)装入逆转录病毒载体pGEZ Term中,脂质体法共转染包装细胞293T,用含有完整病毒颗粒的293T细胞的培养上清感染L929细胞,72 h后,加入Zeocin进行筛选,挑选出能稳定表达PD-1分子的L929细胞株.结果成功克隆了人PD-1基因,构建了含PD-1基因的重组逆转录病毒载体,包装出具有感染能力的重组PD-1逆转录病毒,筛选出具有稳定表达人PD-1分子的L929基因转染细胞.经流式细胞仪检测:PD-1分子在L929基因转染细胞中具有高表达,达到97.6%.结论构建了含人PD-1基因重组逆转录病毒的载体,筛选出稳定表达人PD-1分子的L929细胞株.
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EBV阳性胃癌免疫卡控点干预治疗意义及抗肿瘤作用研究
目的 本研究以EB病毒(EBV)相关胃癌为研究对象,探讨在EBV相关胃癌中介导免疫耐受的免疫卡控点基因,进一步建立靶向于EBV抗原的免疫卡控点基因敲除的细胞毒性T细胞(CTL)的方法,并通过联合低剂量放疗协同免疫细胞发挥抗肿瘤效应,由此建立一种新型的综合免疫治疗模式,评估该治疗模式在EBV相关胃癌治疗中的价值.方法 通过GEO公共数据库分析EBV阳性胃癌相关的免疫调控基因的表达及免疫组化明确相关程序性死亡蛋白1(PD-1)/程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)蛋白表达情况,进一步采用CRISPR-Cas9基因编辑系统,建立PD-1分子敲除的EBV-CTL,评价PD-1分子敲除对EBV-CTL功能的影响;并构建SNU-719荷瘤小鼠模型,联合小剂量放疗评价基因敲除后的细胞在动物体内抗肿瘤作用优势.结果 EBV相关胃癌患者胃癌组织中的免疫相关调控基因明显上调,PD-L1表达水平明显高于非EBV相关胃癌患者.在PD-1敲除的T细胞的基础上,采用EBV相关抗原潜伏膜蛋白2A(LMP2A)诱导的CTL具有更强的γ-干扰素(IFN-γ)分泌水平,在EBV相关胃癌的裸鼠模型中,联合低剂量放疗后该细胞的抗肿瘤效果明显增强.结论 PD-1等免疫卡控点基因的阻断治疗联合细胞治疗有望为EBV阳性胃癌提供新的治疗策略.
关键词： EBV阳性胃癌 CRISPR-Cas9 PD-1基因 细胞治疗 -
EBV阳性胃癌免疫卡控点干预治疗意义及抗肿瘤作用研究
目的 本研究以EB病毒(EBV)相关胃癌为研究对象,探讨在EBV相关胃癌中介导免疫耐受的免疫卡控点基因,进一步建立靶向于EBV抗原的免疫卡控点基因敲除的细胞毒性T细胞(CTL)的方法,并通过联合低剂量放疗协同免疫细胞发挥抗肿瘤效应,由此建立一种新型的综合免疫治疗模式,评估该治疗模式在EBV相关胃癌治疗中的价值.方法 通过GEO公共数据库分析EBV阳性胃癌相关的免疫调控基因的表达及免疫组化明确相关程序性死亡蛋白1(PD-1)/程序性死亡蛋白配体1(PD-L1)蛋白表达情况,进一步采用CRISPR-Cas9基因编辑系统,建立PD-1分子敲除的EBV-CTL,评价PD-1分子敲除对EBV-CTL功能的影响;并构建SNU-719荷瘤小鼠模型,联合小剂量放疗评价基因敲除后的细胞在动物体内抗肿瘤作用优势.结果 EBV相关胃癌患者胃癌组织中的免疫相关调控基因明显上调,PD-L1表达水平明显高于非EBV相关胃癌患者.在PD-1敲除的T细胞的基础上,采用EBV相关抗原潜伏膜蛋白2A(LMP2A)诱导的CTL具有更强的γ-干扰素(IFN-γ)分泌水平,在EBV相关胃癌的裸鼠模型中,联合低剂量放疗后该细胞的抗肿瘤效果明显增强.结论 PD-1等免疫卡控点基因的阻断治疗联合细胞治疗有望为EBV阳性胃癌提供新的治疗策略.
关键词： EBV阳性胃癌 CRISPR-Cas9 PD-1基因 细胞治疗
