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先天性巨结肠肠壁微环境变化对神经干细胞分化和迁移的影响
目的:观察先天性巨结肠(HD)和正常结肠肠壁组织匀浆液对肠神经干细胞分化和迁移的影响.方法:体外培养胎鼠肠神经干细胞,采用Transwell小室的方法比较HD肠壁和正常结肠肠壁组织匀浆液对肠神经干细胞的体外分化和迁移的影响.结果:HD肠壁组织匀浆液与正常结肠肠壁组织匀浆液相比,显著增加肠神经干细胞的体外分化和迁移能力.结论:正常肠神经组织及其微环境中存在可促进肠神经干细胞体外分化和迁移的物质.
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大鼠肠神经干细胞分离和体外培养的初步研究
目的:探索和建立大鼠肠神经干细胞分离与体外培养的方法.方法:取胎龄20 d的SD大鼠肠道,剥取含有肌间神经丛的外纵肌,并以胶原酶消化,获得单细胞悬液;接种单细胞悬液到改良的肠神经干细胞培养液,置于37℃、5%CO2培养箱内常规培养,待神经球出现后进行免疫学鉴定,并观察培养细胞的部分生物学特性.结果:培养第2天有细胞集落形成,第10天左右出现肠神经球;免疫细胞化学染色显示Nestin阳性,已分化的肠神经球免疫双染示TUJ-1、GFAP阳性.结论:初步建立了肠神经干细胞分离与体外培养方法,为下一步肠神经干细胞的移植应用奠定基础.
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肠神经干细胞幽门移植的研究
目的 观察大鼠肠神经干细胞(ENSCs)的培养方法,探讨在同种幽门肌移植的可行性.方法 从胎龄20d大鼠消化道提取ENSCs,体外培养、扩增及鉴定;PKH-26标记后,注射移植至SD幼鼠幽门肌层,分别在移植术后3d及1、2周切片观察移植细胞的活力及分布.结果 提取的细胞经形态学和免疫学鉴定为ENSCs,经流式细胞仪检测β-Ⅲ型微管蛋白(TUJ-1)阳性细胞数为12.3％,胶质纤维酸性蛋白(GFAP)为21.7％,巢蛋白(Nestin)为10.8％,Ret为1.4％.移植后可以观察到标记细胞在幽门肌层保持正常的细胞形态,随着时间延长,移植细胞的分布从不规则性转为规则性排列,并有向黏膜下层迁移的迹象.2周后,细胞仍存活良好.结论 ENSCs移植后能在受体幽门肌层内存活、迁移.
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先天性巨结肠患儿肠神经干细胞培养的实验研究
目的 探索从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取肠神经干细胞的可行性,为进一步开展先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究提供依据.方法 利用1例先天性巨结肠手术切除的扩张段肠管,进行酶消化后,制成单细胞悬液,经体外培养形成神经球,并通过CCK8法检测肠神经干细胞在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h和144 h六个时间点的OD值,绘制生长曲线,记录增殖情况,通过Nestin、GFAP和TUJ-1细胞免疫荧光化学染色对肠神经干细胞及其分化而来的神经元和神经胶质细胞进行鉴定.结果 来自扩张段肠管的单细胞悬液通过原代体外培养10d,可见神经球形成;肠神经球随时间逐渐变大,CCK8法观察肠神经干细胞的OD值随时间而逐渐增高;形成的神经球可以继续传代,经细胞免疫荧光化学染色为Nestin染色阳性,并可分化为神经胶质细胞(GFAP染色阳性)和神经元细胞(TUJ-1染色阳性).结论 能从人类先天性巨结肠患儿的扩张段肠管提取具有自我更新能力的肠神经干细胞,可用于先天性巨结肠的神经干细胞自体移植治疗研究.
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循环型microRNA-92a在先天性巨结肠中的表达及上调CDX2基因的研究
目的 探讨循环型microRNA-92a(miR-92a)在先天性巨结肠(HD)中的表达,以及通过上调尾侧型同源转录因子-2(CDX2)基因抑制肠神经干细胞(ENSCs)增殖的可能机制.方法 选取2013年1月-2015年12月在山东省临沂市沂水中心医院行先天性巨结肠根治术16例HD患儿的术前血清标本.实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测血清miR-92a mRNA的表达.提取孕15d胎鼠肠管ENSCs,通过免疫学方法鉴定ENSCs;免疫磁珠法分选Nestin+ENSCs,脂质体转染使Nestin+ENSCs内过表达miR-92a,噻唑蓝法检测细胞的增殖活性,qRT-PCR、Westem blot检测CDX2基因的表达.结果 HD患儿血清中miR-92a mRNA的相对表达量为(23.5±4.66),高于对照组(t=12.661,P=0.000);ENSCs细胞培养早期Nestin染色阳性,具有向Tuj-1阳性、胶质纤维酸性蛋白阳性细胞分化的潜能;ENSCs过表达miR-92a后,CDX2 mRNA的相对表达为(13.024±3.882),高于对照组(F=47.212,P=0.000),CDX2蛋白表达为(0.436±0.0828),高于对照组(F=48.793,P=0.000),细胞的增殖活性在转染后24、48和72 h明显受抑制.结论 miR-92a通过上调CDX2基因的表达,抑制ENSCs的增殖,可能促进HD发生、发展.
关键词： 先天性巨结肠 循环型miR-92a CDX2基因 肠神经干细胞
