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重组诱导性质粒Egr1-XPO4的构建及其与5-FU联合对肝癌细胞SK-Hep1的协同抑制作用
目的:构建重组诱导性质粒Egr1-XPO4,探讨其与5-FU联合对肝癌细胞SK-Hep1的协同抑制作用.方法:将XPO4基因插入带诱导性启动子Egr1的质粒载体中,构建Egr1-XPO4重组质粒.将Egr1-XPO4质粒转染肝癌细胞SK-Hep1并经化疗药物5-FU诱导,采用Western blotting检测转染细胞中XPO4蛋白表达水平,CCK法检测转染诱导后SK-Hep1细胞的增殖水平,Annexin V-FITC/PI流式细胞仪检测SK-Hep1细胞凋亡情况.动物实验观察Egr1-XPO4质粒联合5-FU对裸鼠移植瘤的治疗效果.结果:成功构建携XPO4基因和启动子Egr1的重组诱导性质粒Eg1-XPO4,重组质粒转染SK-Hep1细胞并经5-FU诱导后,细胞中XPO4蛋白表达量明显增加,且与5-FU的质量浓度明显依赖.Egr1-XPO4转染联合5-FU诱导对SK-Hep1细胞增殖抑制明显强于单纯转染或5-FU诱导(P＜0.05),同时导致SK-Hep1细胞的甲期凋亡率显著高于单纯转染或诱导(P＜0.05).以Egr1-XPO4质粒联合5-FU治疗后,裸鼠肝癌移植瘤的体积明显小于Egr1-XPO4或5-FU单独治疗(P＜0.05).结论:重组诱导性质粒Egr1-XPO4联合5-FU对肝癌细胞SK-Hep1产生协同抑制作用.
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端粒酶线粒体转位与肝癌细胞多药耐药的相关性研究
目的:本研究旨在观察人端粒酶( human telomerase)线粒体转位对肿瘤多药耐药的影响.方法:分别采用顺铂( cisplatin,CDDP)大剂量冲击和间歇诱导的方法处理人肝癌SK-Hep1细胞株,建立具有不同程度耐药指数(resistance index,RI)的人肝癌耐药细胞株;采用CCK-8(cell counting kit-8)法检测各组细胞的药物敏感性,计算半数细胞抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)和RI; FCM法检测细胞周期及凋亡率;免疫荧光染色检测人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)在细胞核和线粒体中的分布;蛋白质印迹法检测hTERT蛋白在全细胞和线粒体中的表达情况;实时定量基因扩增荧光检测系统(real-time quantitativePCR detecting system,Q-PCR)检测SK-Hep1亲本细胞株和各耐药细胞株的端粒相对长度;实时荧光定量-PCR(real-time fluorogenic quantitative-PCR,RFQ-PCR)检测线粒体DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)的氧化损伤;JC-1染色法检测线粒体的膜电位.结果:获得3株对CDDP具有不同程度RI的SK-Hep1细胞,分别命名为SK-Hep1/CDDP1、SK-Hep1/CDDP2和SK-Hep1/CDDP3细胞,CCK-8检测结果显示,它们对CDDP的RI值分别为7.51、9.31和13.76,并对多柔比星和5-氟尿嘧啶有交叉耐药作用.FCM法、免疫荧光染色法、Q-PCR系统、RFQ-PCR法及JC-1染色法的检测结果显示,随着RI值的增加,各耐药细胞株的凋亡率明显降低,hTERT逐渐从细胞核转位到了线粒体中,细胞中的端粒明显缩短,损伤的mtDNA逐渐减少,线粒体膜电位降低.结论:多药耐药肿瘤细胞中端粒酶线粒体转位增加,线粒体端粒酶可发挥保护线粒体的作用.肿瘤细胞通过端粒酶的线粒体保护功能抵抗凋亡.因此,端粒酶线粒体转位可能是肿瘤细胞多药耐药的另一重要的作用机制.
