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角质形成细胞PAR-2基因siRNA的筛选
目的 设计并筛选能高效抑制人角质形成细胞膜上蛋白酶激活受体-2(PAR-2)基因表达的小干扰RNA(siRNA)序列.方法 根据人PAR-2 mRNA的序列,设计合成3对针对靶基因的不同siRNA.应用脂质体Lipofectamin 2000转染试剂,将3对siRNA转染人角质细胞,半定量RT-PCR技术检测PAR-2mRNA表达水平、Western blot检测PAR-2蛋白表达,以评价干扰效果.结果 设计合成的3对PAR-2 siRNA中有2对siRNA可有效抑制PAR-2基因表达,以第2对siRNA效果为佳.结论 成功设计合成特异且高效阻断PAR-2表达的siRNA,为进一步应用RNAi技术沉默PAR-2基因奠定实验基础.
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RNA干扰靶向人端粒酶反转录酶对小儿肝母细胞瘤细胞的生长抑制作用
目的 利用RNA干扰(RNAi)技术降低人端粒酶反转录酶(hTERT)基因的表达,抑制其活性,观察其对小儿肝母细胞瘤细胞的增殖和凋亡影响.方法 构建针对hTERT基因的小干扰RNA (siRNA)真核表达载体——pLXSN-增强型绿色荧光蛋白(EGFP)-U6-siTERT,采用聚合酶链反应(PCR)法扩增hTERT-siRNA、EGFP、U6+ 27的DNA片段,反转录病毒表达载体pLXSN-EGFP-U6-siTERT的构建及酶切鉴定,制备靶向hTERT的重组反转录病毒;用重组反转录病毒感染HepG2小儿肝母细胞瘤细胞,以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)法检测端粒酶活性变化;流式细胞仪检测细胞凋亡率;噻唑蓝(MTT)法检测肿瘤细胞生长抑制.结果 成功制备出hTERT-siRNA反转录病毒表达载体;对照组端粒酶活性为2 143.06±198.69,重组病毒感染作用24、48、72 h后,端粒酶活性分别为1 632.02±116.28、899.38±126.11和321.25±25.25,与感染前比较,分别下降23.84％、58.03％和85.01％,各时间组间差异有统计学意义(P=0.046、0.024和0.008).流式细胞仪检测结果显示:不同滴度的重组病毒感染实验组与对照组的细胞凋亡率比较差异有统计学意义,并呈浓度依赖关系,随着滴度的增加细胞凋亡率增加.1×105菌落形成单位(CFU)重组病毒感染24h后,其凋亡率达29.05％.MTT结果显示,感染后24h细胞凋亡率为29.05％;重组病毒感染后24h,肿瘤细胞开始明显死亡,随着病毒滴度的提高和作用时间延长,细胞死亡亦逐渐加重,病毒滴度为6.0x105 CFU时,感染24、48、72 h后,MTT结果为0.29±0.14、0.20±0.13和0.18±0.11,3.0×105 CFU时,感染24、48、72 h后,MTT结果为0.32±0.11、0.26±0.12和0.25±0.10,1.0×105 CFU时,感染24、48、72h后,MTT结果为0.33±0.12、0.26±0.13和0.26±0.12,1.0×104 CFU时,感染24、48、72 h后,MTr结果为0.43±0.14、0.35±0.10和0.33±0.15,1.0×103 CFU时,感染24、48、72 h后,MTT结果为0.52±0.11、0.44±0.13和0.44±0.10,1.0×102 CFU时,感染24、48、72 h后,MTT结果为0.65±0.13、0.61 ±0.15和0.60±0.16,阴性对照组细胞在24、48、72 h后,MTT结果为0.69±0.11、1.01±0.14和2.98±0.16.显示存在量效和时效关系(P=0.037、0.034、0.028).结论 hTERT-siRNA能特异性抑制hTERT基因表达,端粒酶活性下降,抑制肝母细胞瘤细胞增殖.
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RNAi抑制CYP3A4基因表达的实验研究
目的 探讨质粒表达型短发夹RNA(shRNA)对CHL-3A4转基因细胞的细胞色素P450 3A4(CYP3A4)基因表达的影响.方法 构建3条shRNA真核表达载体(CYP3A4 Ⅰ、CYP3A4 Ⅱ、CYP3A4 Ⅲ),脂质体转染CHL-3A4转基因细胞.转染48h后,RT-PCR和Western blotting分别观察3条shRNA对CYP3A4mRNA和蛋白表达的影响;噻唑蓝观察shRNA抑制环磷酰胺对CHL-3A4转基因细胞毒性作用.结果 CYP3A4 Ⅲ表达载体的shRNA分别能抑制CHL-3A4细胞的CYP3A4mRNA表达(75%)及蛋白表达(80%),抑制环磷酰胺对CHL-3A4细胞(75%)细胞毒作用.结论 RNA干扰能显著抑制CYP3A4基因的表达,RNA干扰技术为肝细胞色素P450的研究提供了新的实验室方法 .
