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hMSCs成骨诱导前后免疫调节的实验研究
目的:从免疫学机制方面探讨人骨髓间充质干细胞(Human bone marrow derived mesenchymal stem cell,hMSCs)、成骨诱导后骨髓间充质干细胞(Osteogenic cells differentiated from mesenchymal stem cells,DOC)免疫调节作用的可能机理.方法:hMSCs、DOC(成骨诱导6天、12天、18天),采用流式细胞技术(FACS),分别检测CD40、CD154、CD80、CD86、HLA-Ⅰ、HLA-Ⅱ在诱导前后其表达水平的变化.hMSCs和DOC(诱导18天),分别作混合淋巴细胞反应(CCK-8法),检测不同数量级hMSCs、DOC体外对双向混合淋巴细胞反应体系同种异体PBMCs增殖的影响,以及不同数量级hMSCs、DOC对经植物血凝素(PHA)刺激后同种异体PBMCs增殖的的影响.结果:hMSCs、DOC低水平表达CD40、CD154、CD80、CD86和HLA-Ⅱ,高水平表达HLA-Ⅰ.不同数量级hMSCs、DOC均可不同程度抑制同种异体PBMCs的增殖反应,其抑制效果大体与细胞量成正比,与阳性对照组相比,均有统计学差异(P＜0.01).结论:在体外实验中,hMSCs、DOC可能通过低免疫原性和降低T细胞的免疫应答从而维持其免疫调节功能.
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hMSCs成骨诱导前后分泌免疫相关细胞因子的实验研究
目的:研究hMSCs、DOC(osteogenic cells differentiated from mesenchymal stem cells,成骨诱导后骨髓间充质干细胞)分泌免疫相关细胞因子的变化,从细胞因子角度探讨hMSCs、DOC形成免疫抑制微环境的可能机理.方法:hMSCs、DOC(成骨诱导18天),采用ELISA技术,分别检测IL-2、IL-4、IL-10和TGF-β1分泌水平的变化.结果:在MSCs、DOC中IL-2、IL-4h低表达或忽略表达,IL-10中度表达,TGF-β1高表达.对IL-2、IL-4、IL-10,hMSCs、DOC的表达水平有统计学差异(P＜0.05).结论:在体外实验中,hMSCs、DOC可能形成免疫抑制微环境并通过其维持免疫调节功能.
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人骨髓间充质干细胞的体外连续传代及鉴定
[目的]将成人骨髓间充质干细胞(hMSCs)进行体外连续传代并对其进行干细胞特性的鉴定.[方法]采用不连续密度梯度离心法进行人骨髓间充质干细胞的分离,使用含10％胎牛血清的L-DMEM进行体外培养,经胰蛋白酶和EDTA联合消化法体外连续传代至P5代后,对其进行生长曲线的测定、细胞周期和表面分子标志物的检测以及多向分化潜能的观察.[结果]本实验可将hMSCs体外连续待至P5代,P5代hMSCs在保持良好的分裂增殖能力的同时,表达hMSCs的表面分子标志物及保持多向分化潜能.[结论]本实验成功地将人hMSCs进行体外连续传代并保持其干细胞的特性.
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腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞成骨特性研究
目的 通过腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染人骨髓间充质干细胞(human marrow mesenchymal stem cells, hMSCs),观察被修饰细胞CTLA-4Ig蛋白表达情况,以及基因修饰对hMSCs诱导成骨特性的影响.方法 采用荧光显微镜观察腺病毒介导CTLA-4Ig基因转染hMSCs的绿色荧光蛋白表达,流式细胞术检测确定转染率,观察对比转染前后细胞形态和细胞周期,用免疫细胞化学方法检测转染hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达,转染hMSCs成骨诱导培养3周后进行成骨特异性标记检测.结果 分离培养的hMSCs CD105表达阳性, CD34表达阴性.重组腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs的转染率为81.14%, CTLA-4Ig基因转染hMSCs(CTLA-4Ig-hMSCs)的形态无明显变化,生长良好.免疫细胞化学结果显示,CTLA-4Ig-hMSCs的CTLA-4Ig蛋白表达阳性,诱导培养3周的CTLA-4Ig-hMSCs,碱性磷酸酶染色呈强阳性,免疫细胞化学检测骨钙素表达阳性,钙的四环素荧光标记法显示细胞间有钙的沉积.结论 腺病毒介导的CTLA-4Ig基因转染hMSCs能够分泌CTLA-4Ig蛋白,并保持了成骨分化潜能,可用于异基因hMSCs作为骨组织工程种子细胞的应用研究.
