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人葡萄糖调节蛋白78文献资料
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人葡萄糖调节蛋白78 shRNA真核表达质粒的构建及其稳定转染A549细胞系的建立
目的 构建人葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78 kD,GRP-78)shRNA真核表达质粒,并建立其稳定转染A549细胞系.方法 根据GenBank中登录的人GRP78基因序列(3309)设计3对互补寡聚单链DNA干扰序列(GRP78-miR-1 、GRP78-miR-2 、GRP78-miR-3)及1对阴性对照,分别插入至载体pcDNA6.2TM-GW/EmGFP,构建shRNA真核表达质粒.在Lipofectamine 3000介导下将各shRNA真核表达质粒分别转染A549细胞,并经Blasticidin S HCl加压筛选稳定的转染细胞系.实时荧光定量PCR和Western blot法检测A549细胞中GRP78基因mRNA转录和蛋白表达水平.结果 各shRNA真核表达质粒经测序鉴定证明均构建正确.稳定转染shRNA真核表达质粒的A549细胞,在荧光显微镜下可见均一表达绿色荧光.与空白对照组比较,A549细胞中GRP78基因mRNA转录和蛋白表达水平明显降低(P＜0.05),阴性对照组无统计学意义(P＞0.05).结论 成功构建了人GRP78的shRNA真核表达质粒,并建立了其稳定转染的A549细胞模型,为进一步研究GRP78在肺癌细胞的侵袭和转移中的作用机制奠定了基础.
关键词： 人葡萄糖调节蛋白78 RNA干扰 真核表达 基因重组 A549细胞
