首页 > 文献资料
-
科尔沁牛中性粒细胞防御素5的原核表达及纯化
目的 原核表达科尔沁牛中性粒细胞防御素5(bovine neutrophil 1β-defensin 5,BNBD5),并进行纯化.方法 用Trizol试剂提取牛外周血中性粒细胞总RNA,RT-PCR法扩增BNBD5的cDNA序列,与pMD18-T载体连接,构建重组克隆质粒pMD18-T-BNBD5,并进行测序,应用DNA Star生物分析软件对科尔沁牛BNBD5与其他物种(绵羊、山羊、驯鹿、家鼠、人类、鳜鱼、中华蜜蜂)B防御素的核苷酸序列进行同源性比较及进化树分析;对科尔沁牛与其他品种牛(新疆荷斯坦牛、印度水牛、荷兰弗里斯兰牛)B防御素的BNBD5核苷酸序列进行进行同源性比较及进化树分析;将构建正确的重组克隆质粒pMD 18-T-BNBD5亚克隆至原核表达载体pET-30a(+),构建重组表达质粒pET-30a-BNBD5,转化大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),IPTG诱导表达后,利用Ni离子亲和柱纯化,SDS-PAGE鉴定表达产物和纯化产物.结果 通过PCR扩增获得了195 bp的BNBD5全长cDNA序列,为一个完整的开放阅读框(ORF),与GenBank中登录的BNBD5编码区序列(AJ278799)相似性达93.4％,推导该序列编码45个氨基酸残基,并含有防御素的特征性分子结构,即在特定位置上有6个保守的半胱氨酸残基;共有13处碱基出现突变,导致其推导的氨基酸序列出现8处变异,但6个保守型半胱氨酸位点均未出现变异.与其他物种的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与山羊、绵羊同源性高,达80％以上;与中华蜜蜂同源性低,在10％以下.与其他品种牛的BNBD5核苷酸序列同源性分析表明,科尔沁牛与新疆荷斯坦牛同源性高,达90％以上;与荷兰弗里斯牛的同源性低,约66％.质粒pET-30a-BNBD5经PCR及单双酶切鉴定证明构建正确,表达及纯化蛋白相对分子质量约10 000,主要以可溶性形式表达,表达量占菌体总蛋白的25.1％,纯化产物含量达2.15 mg/ml.结论 成功表达并纯化了科尔沁牛BNBD5.
