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人内毒素结合肽基因的突变及突变体蛋白表达
目的分析亲代人内毒素结合肽一级结构,选择可能影响其生物学活性的氨基酸对应碱基位点进行突变,克隆基因突变体mEBP基因并研究其蛋白表达.方法以亲代EBP基因为基础,结合DNASIS软件理化性质分析确定突变碱基,应用PCR定点诱变技术进行第5、18位谷氨酰胺→赖氨酸的定点突变.并将其克隆至原核融合表达载体pinpointXa-3,转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS进行表达,经Western blot鉴定.结果突变EBP基因13及52位核苷酸由C突变为A,构建的阳性重组子经酶切及测序鉴定证实与设计序列完全一致,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)pLysS表达生物素化的融合蛋白,Western blot鉴定显示能与抗生物素单克隆抗体结合.结论已成功获得EBP基因突变体,并在大肠杆菌以融合蛋白的形式进行表达.
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新型重组人内毒素结合肽突变体的构建及原核表达纯化
目的 构建新型人内毒素结合肽(a new endotoxin binding peptide consisting of 25 amino acid residues,EBP_(25))及其突变体(mutant of EBP_(25),mEBP_(25))的原核表达重组质粒,并在大肠埃希菌中诱导表达.方法 采用PCR法,扩增EBP_(25)基因,构建pET-30-EBP_(25)融合表达载体并转化E.coli DH5α扩增.重组质粒经酶切和测序鉴定后,应用快速定点突变法将EBP_(25)第2位缬氨酸和第5位谷氨酰胺所对应碱基均替换成赖氨酸所对应的碱基,突变后重组质粒再经测序鉴定后,将二者转化至E.coli BL_(21)(DE_3)PlysS后经IPTG诱导表达,表达产物采用Western印迹进行鉴定后,用His-Tag亲和层析对融合蛋白进行纯化. 结果 两次测序结果 显示人EBP_(25)和mEBP_(25)重组序列和理论设计序列完全一致后,经IPTG诱导表达获得目的融合蛋白,通过SDS-PAGE电泳、Western 印迹证实蛋白表达的特异性,并对蛋白进行纯化,获得EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白. 结论 构建、表达纯化了EBP_(25)和mEBP_(25)融合蛋白,为进一步研究其中和内毒素/脂多糖活性奠定了基础.
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内毒素结合肽在烧伤合并内毒素血症大鼠模型中的作用
目的观察重组人内毒素结合肽蛋白在烧伤合并内毒素血症大鼠中的作用.方法采用烧伤合并内毒素血症大鼠模型,分为模型组(n=36)、治疗组(n=36)及对照组(n=6).模型组在烧伤后立即腹腔内注射1 mg/kg 内毒素(用1 ml生理盐水配制);治疗组腹腔内注射1 mg/kg内毒素(用0.5 ml生理盐水配制)后,再注入400 μg/kg制备好的内毒素结合肽(用0.5 ml生理盐水配制);模型组和治疗组分别在处理后1、3、6、12、24、48 h取血和肝、肺组织,对照组仅在脱毛后腹腔内注入1 ml生理盐水,取血和肝、肺组织作总体对照.采用生化速率法、ELISA法及组织学切片染色和电镜制样等方法,测定血清中丙氨酸转氨酶(ALT)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素-6(IL-6)的含量变化以及光、电镜观察肝、肺组织的病理学变化.结果模型组于伤后1 h血清TNFα显著高于对照组(P<0.01),6 h达峰值;治疗组与模型组比较各时相点血清TNFα含量均显著降低(P<0.01, P<0.05).血清IL-6含量测定结果,模型组于伤后1 h血清IL-6显著高于对照组(P<0.01),12 h达峰值.治疗组3～48 h各时相点血清IL-6含量均显著低于模型组(P<0.01, P<0.05).大鼠血清中谷丙转氨酶的动态变化提示,模型组大鼠血清ALT水平较正常组显著升高(P<0.01),治疗组大鼠的血清ALT水平和模型组相比显著降低(P<0.01, P<0.05).组织病理学变化方面,治疗组中肝细胞的变性程度减轻,炎细胞浸润减少;肺间质充血、出血及肺泡间隔的炎性改变也有不同程度减轻.结论重组人内毒素结合肽EBP在烧伤合并内毒素血症大鼠中具有一定的生物活性和保护作用.
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一种合成的新型内毒素结合肽突变体的体内外拮抗内毒素效应初步研究
目的 设计构建新型内毒素结合肽突变体( mutant of endotoxin binding peptide,mEBP),并研究其体内外拮抗内毒素效应.方法 采用F-moc固相合成法获得内毒素结合肽(endotoxin binding peptide,EBP)及其突变体mEBP;CCK-8法检测mEBP对RAW264.7细胞增殖的影响；ELISA法检测mEBP对内毒素(lipopolysaccharide,LPS)诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6的影响；Western blot法检测mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞表达p-p38 MAPK的影响；中性红法测定mEBP对LPS诱导的RAW264.7细胞吞饮功能的影响.复制烧伤合并内毒素血症小鼠模型；检测mEBP对建模后6h小鼠血浆中TNF-α、ALT和AST浓度的影响；检测mEBP对模型小鼠48 h生存率的影响.结果 mEBP无可见的细胞毒性；mEBP可降低LPS诱导的RAW264.7细胞分泌TNF-α和IL-6( P＜0.05)；抑制p-p38 MAPK信号通路的激活；抑制RAW264.7细胞的吞饮功能(P＜0.01)；mEBP预处理可明显降低烧伤合并内毒素血症模型小鼠血浆中的TNF-α、ALT和AST浓度(P＜0.05),提高模型小鼠48h生存率.结论 mEBP和EBP均具有明显的拮抗内毒素活性,其中mEBP拮抗活性更强.
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内毒素结合肽及其突变体的表达纯化和抗内毒素/脂多糖活性研究
目的 使内毒素结合肽(EBP)及其突变体mEBP在E.coli DH5α中表达,纯化后鉴定其抗内毒素/脂多糖(LPS)活性.方法 (1)将含PinpointXa3-EBP及其突变体PinpointXa3-mEBP的工程菌DH5α活化,加入异丙硫半乳糖苷(IPTG)诱导其表达生物素融合蛋白.分离纯化表达产物,因子Xa酶切融合蛋白分离目的肽EBP和mEBP.采用亲和层析及反相高效液相色谱法纯化目的肽,用氨基末端10个氨基酸残基序列分析法鉴定突变体mEBP.(2)分离正常人外周血单核细胞(PBMC),用5 mg/L异硫氰酸荧光素(FITC)-LPS+不同浓度EBP或mEBP(均为2.0、5.0、12.5 mg/L)刺激PBMC,检测其平均荧光强度.用1 mg/L LPS+3种浓度(同前)EBP或mEBP刺激PBMC,5 h后取上清液,检测肿瘤坏死因子(TNF)α和白细胞介素(IL)6浓度.(3)将25只昆明小鼠分为正常对照组(5只):腹腔注射等渗盐水0.2 ml;模型组(5只):小鼠造成20%TBSAⅢ度烧伤,伤后腹腔注射LPS(1 mg/kg);治疗组(15只):小鼠同前致伤后,腹腔注射多黏菌素B(PMB,5 mg/kg)或EBP或mEBP(后两者均为10 mg/kg).6 h后检测各组小鼠血清TNF-α、IL-6浓度及肝组织中TNF-α mRNA的表达水平.结果 (1)纯化后的目的肽EBP、mEBP纯度均达98%以上,mEBP氨基末端10个氨基酸残基序列分析符合预期结果.(2)随着mEBP或EBP浓度的增加,PBMC表面的平均荧光强度逐渐减弱;且在同一浓度下,加入mEBP后平均荧光强度的减弱程度较加入EBP明显.与用1 mg/LLPS刺激PBMC比较,加入1 mg/L LPS+12.5 mg/L EBP以及1 mg/L LPS+3种浓度mEBP刺激后,PBMC培养上清液中IL-6及TNF-α的水平均明显降低(P＜0.01).(3)与模型组比较,治疗组小鼠血清IL-6、TNF-α水平均明显降低(P＜0.01),其中10 mg/kg mEBP治疗组两指标低于等浓度EBP治疗组(P＜0.05).(4)小鼠肝组织TNF-α mRNA表达水平:正常对照组相对灰度值为0.25,模型组为0.93,10 mg/kg mEBP治疗组为0.51,10 mg/kg EBP治疗组为0.77,5 mg/kg PMB治疗组为0.43.结论 具有抗LPS活性的小分子肽可通过原核表达获得;EBP及mEBP均具有抗LPS活性,其中mEBP拮抗作用更强.
