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HT22细胞氧糖剥夺再灌注及 Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制研究
目的：探讨HT22细胞氧糖剥夺再灌注及Grasp65过表达干预后高尔基体的形态变化及其可能机制。方法利用小鼠海马神经元细胞系HT22为研究对象，HT22细胞经氧糖剥夺再灌注损伤及Grasp65过表达干预后，采用MTT法检测细胞存活率；Hoechest33258荧光染色法评估细胞凋亡；并应用细胞免疫荧光技术观察高尔基体的形态；应用Western blot技术检测GM130和GAAP蛋白的表达。结果氧糖剥夺再灌注可导致HT22细胞的活性显著降低（P＜0．05），凋亡率显著增高（P＜0．05）；并可导致高尔基体形态的异常，随着再灌注时间的延长，高尔基体逐渐发生碎裂，尤其以再灌注12 h和24 h为明显；GM130、GAAP的表达水平在氧糖剥夺再灌注后出现下降，特别是在再灌注12 h、24 h后出现了显著下降（P＜0．05）。过表达Grasp65后，HT22细胞在氧糖剥夺再灌注所致高尔基体碎裂出现减少（P＜0．05），碎裂程度减轻，同时GM130和GAAP的表达均显著增加（P＜0．05），HT22细胞的存活率大大提高（P＜0．05），凋亡率显著降低（P＜0．05）。结论缺血再灌注损伤的细胞模型中，同样发生了高尔基体的碎裂；过表达Grasp65可以减轻氧糖剥夺再灌注损伤所致的高尔基体碎裂，并可以减少HT22细胞的凋亡，其机制可能与上调GM130和GAAP的表达有关。
关键词： 高尔基体碎裂 凋亡 小鼠海马神经元系HT22 Grasp65 GM130 -
CVB3损伤HeLa细胞高尔基体结构的机制研究
目的 研究CVB3损伤HeLa细胞高尔基体结构的机制,为进一步探讨CVB3的致病机制奠定基础.方法 采用MOI为5的CVB3感染HeLa细胞,免疫荧光双标法检测病毒感染后不同时间点VP1和GM130在细胞中的定位情况,观察细胞高尔基带的变化;同时,选择CVB3感染后不同时间点收集细胞,Bradford法蛋白定量后.Western blot测定VP1、GM130和GRASP65蛋白的表达变化.结果 正常HeLa细胞中GM130和GRASP65免疫荧光呈带状分布,高尔基体结构正常;而CVB3病毒感染HeLa细胞3h后,GM130的荧光呈现散点状分布,高尔基体结构损伤.与此同时,GM130和GRASP65蛋白表达量逐渐下降;而VP1蛋白表达量持续上升,且6h后一直维持在较高水平.结论 CVB3感染引起HeLa细胞蛋白GM130和GRASP65表达量下调,导致GM130和GRASP65荧光带弥散,高尔基带断裂,这可能是CVB3感染导致宿主细胞高尔基体结构损伤的机制之一.
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GRASP65的表达对胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响
目的:探讨高尔基体堆叠蛋白65(Golgi reassembly stacking protein 65,GRASP65)在体外对人胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的影响.方法:首先,通过Western blot和RT-qRCR鉴别低分化胃癌细胞MKN-45、中分化胃癌细胞SGC-7901、高分化胃癌细胞MKN-28和正常胃黏膜细胞GES-1中GRASP65蛋白和mRNA的表达量.然后,用siRNA干扰技术通过Lipofectamine 2000瞬时转染下调和MKN-45细胞中GRASP65的表达量.用qRT-PCR和Western blot检测转染后各组细胞中GRASP65的蛋白和mRNA表达量以证实转染成功.后,用CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验检测转染后的各组胃癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭能力的改变.结果:Western blot和qRT-RCR结果显示MKN-45细胞和SGC-7901细胞中GRASP65的蛋白和mRNA表达量明显高于MKN-28细胞和GES-1细胞中GRASP65蛋白和mRNA表达量(P＜0.05),故选择低分化胃癌细胞MKN-45作为实验细胞株来下调GRASP65的表达量.qRT-PCR和Westem blot结果证明转染成功,转染组GRASP65的mRNA和蛋白表达量与阴性对照组和空白对照组对比有统计学意义(P＜0.05).CCK-8、流式细胞术、Transwell迁移和侵袭实验均证明,下调MKN-45细胞的GRASP65的表达量可抑制胃癌细胞MKN-45体外增殖、迁移和侵袭能力,并促进细胞凋亡.结论:下调GRASP65的表达可明显减弱胃癌细胞的体外增殖能力,同时促进胃癌细胞的凋亡、体外侵袭和迁移.
