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抗人LOC51255单克隆抗体的制备及亚细胞定位
目的:制备抗人LOC51255单克隆抗体,并构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒,了解LOC51255在人肝癌细胞株HepG2中的亚细胞定位情况,为进一步研究其功能提供实验工具和基础.方法:以纯化的重组蛋白pET28b/LOC51255为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备LOC51255单克隆抗体,并用间接ELISA法和Western blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定;通过构建含红色荧光蛋白(pDsRed1)的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒,转入人肝癌细胞株HepG2表达重组蛋白,并对LOC51255进行亚细胞定位.结果:成功建立2株稳定分泌抗LOC51255单克隆抗体的杂交瘤细胞株;ELISA检测抗LOC51255单克隆抗体的腹水效价分别为1∶12 800和1∶25 600.2株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为IgG1.通过Western blot实验证实,2株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性LOC51255蛋白.荧光显微镜观察发现LOC51255主要定位于HepG2细胞的细胞浆.结论:成功制备了2株效价高、特异性好的抗LOC51255单克隆抗体,制备的单克隆抗体可用于LOC51255蛋白的鉴定;亚细胞定位分析证实LOC51255主要表达于HepG2细胞的胞浆,为LOC51255的生物学功能研究奠定了基础.
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抗HSPC238单克隆抗体的制备和初步鉴定
目的 制备抗HSPC238的单克隆抗体,为HSPC238的功能研究奠定基础.方法 以纯化的重组蛋白HSPC238为抗原,免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备HSPC238单克隆抗体,并用问接ELISA法和Westem-blot法对单克隆抗体的特性进行鉴定.结果 成功建立两株稳定分泌抗HSPC238的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为E001和E002.ELISA检测抗HSPC238单克隆抗体的腹水效价为1:12800和1:25600.两株单克隆抗体的免疫球蛋白亚类均为Ig异G1.通过Western-blot实验证实,两株单克隆抗体均能特异性结合真核细胞内源性HSPC238蛋白.结论 成功制备了两株效价高、特异性好的抗HSPC238单克隆抗体,制备的抗HSPC238单克隆抗体可用于HSPC238蛋白的鉴定,为HSPC238蛋白的生物学功能研究奠定了基础.
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pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒的构建及在HePG2细胞的表达定位
目的:构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒并检测其在人肝癌细胞株HePG2中的表达和亚细胞定位.方法:采用PCR法从pET28b/LOC51255重组质粒中克隆得到LOC51255 cDNA全长序列, 并将该片段亚克隆到真核表达载体pDsRed1-C3中.构建好的pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒经双酶切和测序鉴定后, 采用脂质体法将该重组质粒转染人肝癌细胞株HePG2, 再用荧光显微镜直接观察LOC51255在其中的表达及定位情况.结果:经双酶切及DNA测序结果证实成功构建重组质粒pDsRed1-C3/LOC51255;荧光显微镜观察证实该重组质粒能在HePG2细胞中表达, 且LOC51255蛋白主要定位于HePG2细胞的细胞质.结论:成功构建pDsRed1-C3/LOC51255真核表达质粒, 并在HePG2细胞中得到表达, 同时证实LOC51255定位于HePG2细胞的胞质, 为进一步研究人类LOC51255基因的功能奠定了基础.
