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ODDD调节HSV-TK/GCV对乏氧环境宫颈癌Hela细胞特异杀伤作用的研究
目的:构建一种由氧依赖降解结构域(oxygen dependent degradation domain,ODDD)调控的单纯疱疹病毒胸苷激酶(herpes simplex virus thymidine kinase,HSV-TK)基因表达的真核表达载体,观察ODDD能否使HSV-TK/GCV(gancyclovir)系统对乏氧环境中的宫颈癌Hela细胞有特异杀伤作用.方法:RT-PCR从Hda细胞中钓取ODDD片段,将PCR产物克隆入荧光报告载体pEGFP-C1,获得质粒pEGFP-ODDD;PCR扩增HSV-TK基因,将其克隆到pEGFP-ODDD和pEGFP-C1的下游,获得重组质粒pEGFP-ODDD-TK及pEGFP-TK.荧光报告载体pEGFP-ODDD转染Hela细胞,24 h后应用流式细胞术检测在乏氧(O2浓度为1%)和常氧(O2浓度为21%)环境下细胞中EGFP表达强度.将具有相同转染效率的pEGFP-ODDD-TK和pEGFP-TK的Hela细胞分别予以GCV处理,5天后用MTT法检测GCV对培养细胞的杀伤效果.结果:ODDD序列和HSV-TK序列与预期一致;含有ODDD片段荧光报告载体的Hela细胞在正常氧浓度下EGFP的表达量为11.96%,低于缺氧条件下39.92%;在乏氧环境下,转染pEGFP-ODDD-TK的Hela细胞对GCV的敏感性高于正常氧含量组(P＜0.0),而转染pEGFP-TK的Hela细胞在常氧和乏氧环境下对GCV的敏感性差异无统计学意义(P＞0.05).结论:成功地构建了含有ODDD序列调控的HSV-TK真核表达载体,ODDD能特异发挥HSV-TK/GCV系统对乏氧环境Hela细胞的杀伤作用.
关键词： 缺氧 Hela细胞 氧依赖降解结构域 单纯疱疹病毒胸苷激酶 绿色荧光蛋白 -
ODDD调控EGFP基因的乏氧特异表达载体的构建及其意义
目的:构建乏氧诱导因子的氧依赖降解结构域(ODDD)调控的乏氧特异性表达荧光报告载体,探索其乏氧调控目的基因表达的可行性.方法:基因重组技术构建含有序列ODDD403-601aa、ODDD549-575aa和其2串联体调控增强型绿色荧光蛋白(EGFP)荧光报告载体.φA细胞中瞬时表达EGFP,应用RT-PCR技术、Westernblotting技术和流式细胞术检测ODDD调控EGFP乏氧特异性表达.结果:克隆得到了ODDD/EGFP表达载体,进行细胞转染实验,在细胞中成功表达EGFP.Western blotting检测,ODDD可以调控EGFP乏氧特异性表达.流式细胞术检测,正常氧浓度下细胞转染pEGFP-ODDD401-603、pEGFP-ODDD549-575和pEGFP-ODDD2(549-575) EGFP的荧光强度分别为(6.06±1.97)％、(11.99±1.13)％和(23.16±2.79)％,低于缺氧条件下EGFP的表达量(P＜0.05).结论:ODDD对靶基因对氧的反应性调节受细胞内的蛋白酶影响；ODDD的调控作用发生在翻译后的蛋白水平,且与细胞内蛋白酶系统功能密切相关.
