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MYCT1新转录本的克隆与表达分析
目的：确定MYCT1基因的转录起始点并克隆该基因新的转录本，探讨该基因的结构和功能。方法利用已知MYCT1的保守序列，应用5′-RACE技术确定转录起始点位置，结合3′-RACE拼接得到新转录本的精确全长；然后利用生物信息学软件对新转录本与MYCT1的cDNA序列及氨基酸序列进行对比分析；后利用RT-PCR的方法分析新转录本的细胞表达谱。结果成功克隆得到长1106 bp的新转录本MYCT1-TV，其转录起始点位于ATG上游140 bp处。MYCT1-TV与MYCT1在结构上无明显差异，并广泛表达于各个细胞系。结论 MYCT1转录起始点的确定和新转录本MYCT1-TV的克隆，为进一步研究MYCT1基因的转录调控机制及基因功能奠定了实验基础。
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MYCT1-GST原核表达载体的构建及鉴定
目的 构建MYCT1-GST原核表达载体,并纯化MYCT1-GST融合蛋白.方法 以正常人外周血cDNA为模板,PCR方法扩增该基因的开放阅读框,定向克隆至pET28a(+)载体后送测序鉴定.将构建好的MYCT1-GST表达载体转化至BL21 (DE3)菌株,通过IPTG诱导表达,PCR结合测序方法鉴定载体构建是否成功,Western blotting方法鉴定MYCT1-GST融合蛋白的表达.结果 测序结果证实成功将MYCT1的开放阅读框克隆至pET28a(+)表达载体,经诱导后成功纯化了MYCT1-GST融合蛋白.结论 成功构建MYCT1-GST表达载体,为进一步研究MYCT1相互作用蛋白质奠定了基础.
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MYCT1-TV真核表达载体的构建及鉴定
目的：构建 MYCT1-TV（ Myc target 1 transcript variant 1）真核表达载体，鉴定其在肝癌细胞系Bel7402中的表达。方法：以正常人外周血cDNA为模板，RT-PCR方法扩增该基因的开放阅读框，定向克隆至pEGFP-C1载体后送测序鉴定。将构建好的MYCT1-TV-GFP表达载体瞬时转染Bel7402细胞，RT-PCR结合荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况并鉴定载体构建是否成功。结果：测序结果证实成功将MYCT1-TV的开放阅读框克隆至pEGFP-C1表达载体，且转染细胞后，MYCT1-TV mRNA的表达水平显著上调，荧光显微镜下可见细胞内重组绿色荧光蛋白的表达。结论：成功构建MYCT1-TV-GFP表达载体，为进一步研究MYCT1-TV在肝癌中的作用机制奠定了基础。
