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阿维菌素产生菌的诱变育种
目的提高产生菌B1a组分的产量.方法采用诱变剂亚硝基胍处理菌种,以含1 g·L-1甲硫氨酸的分离培养基作为定向筛选的分离平板,挑选生长快的菌落进行初筛、复筛.结果筛选得到高产菌株中B组分含量显著提高,其中得到的突变株M-20经摇瓶初、复筛和传代实验表明是稳定的B组分高产变异株,其B组分含量达82.1%,较出发菌株提高14.6%,其中B1组分达52.4%,较出发菌株提高19.3%.结论采用NTG诱变结合使用含1g·L-1甲硫氨酸的平板进行筛选可以获得阿维菌素B组分显著提高的菌株.
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前体氨基酸对avermectin生物合成的影响
Avermectin(AVM)是十六元大环内酯类抗生素,其类似物的组成及产量受外源氨基酸的强烈影响.本文研究了Asp、Thr、Val、Met、Ile五种前体氨基酸对avermectin生物合成的影响.实验结果表明在发酵开始前加入0.05%的异亮氨酸,AVMB1a的效价比对照提高了200%.同时,初步定量研究了添加各种氨基酸对avermectin产生菌除虫链霉菌的菌丝形态的影响,探讨了菌形与avermectin合成能力的相关性.
关键词： avermectin 氨基酸 生物合成 除虫链霉菌 菌丝形态 -
质谱仪在 avermectin发酵过程中的应用
在除虫链霉菌发酵过程中,国内首次成功引入质谱仪进行尾气的在线测定,从而有助于过程的控制与理解.通过进行数据关联,发现质谱测定的数据更为全面和精确,由此计算的间接参数更为合理;呼吸商可以作为葡萄糖浓度过低的预警,参与补料速率控制;另外还找到临界通气量为 1600m3/h.
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链霉素抗性突变理性筛选avermectin高产菌株
为提高菌株avermectin的产量,本文以链霉素抗性为选择压力,对除虫链霉菌Streptomyces avermitilis进行紫外诱变(253.7nm,30w,照射时间45s),得到在摇瓶发酵水平比出发菌株产量提高25%以上的4株突变株,其中2株提高水平达30%以上.实验表明了链霉素抗性突变与产抗生素突变之间的密切联系.同时,对其机理和意义作了一些探讨.
关键词： avermectin 除虫链霉菌 链霉素抗性 理性筛选 -
利用合成多位点突变aveC*基因提高多拉菌素工业菌株中有效活性组份的含量
目的 合成多位点突变的aveC*基因用于提高除虫链霉菌工业菌株产生多拉菌素(CHC-B1)组份的含量.方法 利用相互重叠的引物进行PCR扩增,合成多位点突变的aveC*基因.利用PCR打靶技术获得aveC*基因发生置换的突变株.结果 用32条引物进行PCR扩增,获得了10个位点突变的aveC*基因.构建了打靶载体pFX-HA,在基因组上将aveC*基因原位替换成了aveC*基因.所获得的突变株LF2发酵产生多拉菌素组份的纯度由出发菌株的25％提高到93％,发酵效价达到691.5mg/L.结论 除虫链霉菌工业菌株基因组中原位替换的多位点突变的aveC*基因可以大幅度提高多拉菌素组份的含量,降低工业提取纯化的成本.
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5-酮基avermectin基因工程菌的构建
采用基因插入失活的方法,将1.5kb安普霉素抗性基因插入1.8kb aveF基因内部SalI位点,构建重组质粒pPC-5,并转化除虫链霉菌D2-14,获得基因工程菌株AV-F1.经HPLC分析,发现该菌株主要产生两个组分,分别为5-酮avermectin 1a和5-酮avermectin 2a,还产生一个小组分为acermectin B1a.5-酮avermectin基因工程菌株的构建成功,为化学合成新的avermectin衍生物提供了可利用的原料来源.
关键词： 除虫链霉菌 avermectin 5-酮avetmectin 基因失活 -
构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造
以容纳DNA大片段的柯斯质粒Supercos-1为载体.构建了除虫链霉菌的基因组文库.对约1000个柯斯质粒上插入片段的两端进行测序,并利用全基因组序列的信息,构建了覆盖约91%基因组的有序排列的柯斯文库.利用入λ-Red高效DNA重组和大肠埃希菌-链霉菌接合转移技术,建立了除虫链霉菌的基因组遗传操作系统.运用该系统可以在除虫链霉菌工业菌株中进行高效、精确的基因敲除工作和连续的基因缺失研究,获得可以用来生产多拉菌素的工程菌株.
