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熟地黄干预小鼠焦虑行为实验
目的:观察熟地黄的抗焦虑作用,并初步探讨其机制.方法:实验于2003-09/2005-09在河南中医学院动物实验中心和中药研究室进行.60只昆明种小鼠,按体质量随机分为5组:对照组,地西泮组,熟地黄高、中、低剂量组各10只.对照组每天灌胃生理盐水;地西泮组前4 d每天灌胃生理盐水,后3d灌胃地西泮2.5 mg/(kg·d);熟地黄高、中、低剂量组灌胃熟地黄分别为12,8,4g/(kg·d),连续7 d.7 d后开始进行小鼠明暗穿箱实验、小鼠高架十字迷宫实验,观察记录10 min内小鼠穿箱次数,分别记录实验期5 min内小鼠进入开放臂和封闭臂的次数、停留时间及在两臂滞留的总时间.计算小鼠进入开臂的次数和在开臂滞留时间分别占总入臂次数和总入臂时间的百分率,以此作为评价药物抗焦虑作用的指标.取对照组、地西泮组及熟地黄中剂量组小鼠行为学观察后立即处死,剥离大脑,用薄层扫描法测定γ-氨基丁酸、谷氨酸含量;用免疫组化法测定GABAAR1、N-甲基-D-天冬氨酸受体1表达.组间比较采用t检验.结果:60只小鼠均进入结果分析.①与对照组比较,地西泮、熟地黄中剂量组能显著增加小鼠的穿箱次数[(17.1±4.6),(32.5±13.7),(26.7±4.1)次,P＜0.01],地西泮与熟地黄中剂量组比较,差异不显著.②与对照组比较,地西泮组进入开臂的时间百分率、次数百分率显著增加[(4.51±2.31),(10.83±6.92)%;(14.46±10.71),(25.80±3.61)%,P＜0.05,P＜0.01],熟地黄中剂量组进入开臂的次数百分率显著增加[(14.46±10.71),(25.42±6.86)%,P＜0.01].地西泮组与熟地黄中剂量组比较,差异不显著.③与对照组比较,熟地黄中剂量组、地西泮组小鼠脑组织中谷氨酸含量显著降低[(571.70±52.27),(477.41±41.10),(454.64±32.60)μg/g,P＜0.01],γ-氨基丁酸含量显著提高[(182.52±8.65),(239.56±18.00),(295.10±14.83)μg/g,P＜0.01].熟地黄中剂量组与地西泮组比较,差异不显著.④与对照组比较,熟地黄组GABAAR1免疫阳性细胞表达增加;N-甲基-D-天冬氨酸受体1免疫阳性细胞表达表达减少.结论:熟地黄在小鼠明暗箱模型和小鼠高架十字迷宫模型上均表现出抗焦虑作用,其作用效果与地西泮类似.作用机制与提高中枢γ-氨基丁酸含量,增强GABAAR1表达;降低谷氨酸含量,减少N-甲基-D-天冬氨酸受体1表达有关.
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PICK1蛋白83位点氨基酸对PDZ结构域的影响
目的:研究PICK1 (protein interacting with C kinase 1)蛋白PDZ结构域内83位点赖氨酸( K83)对PICK1和AMPA受体GluR2亚单位相互作用的影响.方法:利用计算机对PICK1 PDZ结构域和GluR2 C末端4个氨基酸残基进行对接模拟,然后将K83进行虚拟点突变,计算并观察突变后结构和键能的改变.利用实验室已有的野生型全长PICK1 cDNA质粒为模板,构建点突变质粒,与野生型GluR2共转到HEK293T细胞,观察两者在细胞内定位和分布的改变.结果:当野生型PICK1与GluR2共转染时,HEK293T细胞有大量PICK1和GluR2共定位的集簇(cluster).当我们把构建的PICK1突变体与GluR2共转染时,不同的突变体表现出不一样的改变.结论:改变K83位点的氨基酸结构,很可能会改变PICK1 PDZ结构域与GluR2 C末端结合所形成的疏水、氢键、静电相互作用,使得PDZ结构域与GluR2 C末端的结合能力发生不同程度的改变.
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MK-801预处理对心脏骤停-心肺复苏大鼠脑缺血再灌注损伤的影响及机制
目的 探讨心脏骤停前30 min经股静脉注射1 mg/kg地卓西平(MK-801)对心脏骤停-心肺复苏大鼠兴奋性氨基酸及炎症反应的影响.方法 18只雄性SD大鼠随机分为对照组、心脏骤停(CA)组及CA+ MK-801组,建立心脏骤停-心肺复苏模型,留取血清标本和脑组织,HE染色观察神经元的损伤情况,Western blot检测脑组织中谷氨酸受体(NMDAR)蛋白表达,ELISA法检测血清中白介素-1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的浓度.结果 CA组中神经元排列紊乱,胞体缩小,胞核固缩,胞质嗜酸性增强,并伴有炎性细胞浸润;MK-801预处理后,神经元的病理性损伤减轻,巨噬细胞浸润程度减轻.CA组NMDAR的蛋白表达量较正常组明显增加(907.9±24.9 vs 321.6±18.4,P＜0.01);MK-801预处理后NMDAR的相对表达量较CA组下降(512.4 ±21.1 vs 907.9±24.9,P＜0.01).CA组中IL-1β和TNF-α的浓度较对照组增加,差异有统计学意义(P＜0.05);用MK-801预处理后,IL-1β和TNF-α的浓度明显下降(P＜0.01),但较对照组高.结论 MK-801预处理对心脏骤停-心肺复苏大鼠脑缺血再灌注损伤具有一定的神经保护作用,该作用可能与抑制细胞因子的表达、下调炎症反应程度有关.
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第三组代谢型谷氨酸受体在疼痛作用中的研究
疼痛是机体受到伤害性刺激所产生的由感觉识辨、情感动机、认知评价组成的一种复杂的情感体验和主观感觉,是伤害性感受器受到外周伤害性刺激作用而产生的一种疼痛信号,该信号在经过脊髓上传至高级中枢的过程中,受到脊髓自身和脊髓上中枢的调控.疼痛机制目前还不明确,可能涉及多种潜在机制,如离子通道、神经递质和受体的表达等.谷氨酸(Glu)是哺乳动物脑内主要的兴奋性神经递质之一,参与多种生理和病理过程,例如突触传递、神经元的发育和死亡、突触可塑性、长时程增强、长时程抑制以及某些神经系统疾病的发病[1].谷氨酸受体分为两大类:离子型(iGluRs)和代谢型(mGluRs).近年研究发现,mGluRs在痛觉的传导中发挥关键作用,它通过复杂的信号转导通路调节突触传递和神经元的兴奋性,从而调节疼痛的发生发展和维持[2].mGluRs包括三组,笔者主要就第三组mGluRs(mGluR4、mGluR6、mGluR7、mGluR8)与疼痛的关系综述如下.
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DREAM对骨癌痛-吗啡耐受大鼠脊髓谷氨酸转运体-1表达的影响
目的 研究下游调控元件拮抗分子DREAM对骨癌痛-吗啡耐受大鼠脊髓谷氨酸转运体-1(GLT-1)表达的影响.方法 健康雌性SD大鼠60只,体质量200 ～ 230 g,按随机数字表法分为癌痛组(CP组,n=48)和假手术组(S组,n=12).于接种前1 d(T0),接种后第7天(T1)、14天(T2)、18天(T3)、19天(T4)、21天(T5)、25天(T6)和28天(T7)检测机械痛阈.术后T2～ T3,随机取CP组中36只大鼠行皮下吗啡注射,每日单次剂量依次为10、20、30、40和60 mg/kg,3次/d.T4时,皮下注射吗啡3 mg/kg.术后20 ～ 25 d,依鞘内注射物质不同,将经吗啡处理过的大鼠分为吗啡耐受组(MT组,n=12)、RNAi组(R组,n=12)和载体组(V组,n=12).术后28 d,取其L4脊髓,检测术侧脊髓DREAM和谷氨酸转运体-1(GLT-1)的表达变化.结果 (1)机械痛阈:与S组比较,CP组、MT组、V组和R组在T1、T3、T5～T7时降低,CP组在T2时降低,MT组、V组和R组在T4时降低;与CP组比较,MT组、V组及R组在T2 ～T3时升高(P＜0.01),T4时降低(P＜0.01),R组在T5时降低(P＜0.01),MT组和V组在T5～T7时降低(P＜0.01).与MT组和V组比较,R组在T6～T7时升高(P＜0.01).(2)脊髓DREAM基因mRNA和DREAM蛋白含量:与S组比较,其他各组脊髓DREAM基因mRNA和DREAM蛋白含量均显著增高(P＜0.01);与CP组比较,MT组和V组表达均增加(P＜0.01),R组表达减少(P＜0.01);与MT组和V组比较,R组表达减少(P＜0.01).(3)GLT-1表达:与S组比较,其他各组GLT-1表达均减少(P＜0.01);与CP组比较,MV组、V组和R组表达G LT-1表达均减少(P＜0.01).结论 DREAM参与骨癌痛-吗啡耐受机械痛敏的维持,对脊髓GLT-1的表达未见明显影响.
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色素上皮衍生因子对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响
目的 观察色素上皮衍生因子(PEDF)对糖尿病大鼠视网膜谷氨酸代谢的影响.方法 Sprague_Dawley大鼠78只,分为模型组、模型对照组、PEDF干预组(干预组)、干预对照组,实验结束时去除血糖恢复鼠和实验期间死亡鼠,每组以12只大鼠作为统计样本.模型组、干预组、干预对照组大鼠采用链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠模型.模型组大鼠不作任何干预,模型对照组为相同月龄的正常大鼠.干预组大鼠左眼玻璃体腔注射0.1 μg/μl的PEDF 5.0μl,干预对照组大鼠左眼玻璃体腔注射相同容积的磷酸盐缓冲液.采用蛋白免疫印迹法(Western bolt)和实时荧光聚合酶链式反应(PCR)法检测视网膜L-谷氨酸-L-门冬氨酸转运体(GLAST)表达的变化,高压液相色谱法(HPLC)观察视网膜谷氨酸的含量变化.将体外培养的大鼠视网膜Müller细胞随机分为对照组、实验组、PEDF干预组(干预组)和干预对照组,荧光免疫法和实时荧光PCR法检测Müller细胞GLAST表达的改变,根据[3H]标记的D,L-谷氨酸摄入量判断Müller细胞的摄取功能.结果 实时荧光PCR法和Western bolt检测结果显示,相对于模型对照组大鼠,模型组大鼠视网膜GLAST表达降低(实时荧光PCR法:t=8.86,P＜0.01;Western blot:t=3.42,P＜0.05),视网膜谷氦酸含量升高(t=4.01,P＜0.05);干预组大鼠视网膜GLAST表达与干预对照组视网膜GLAST表达比较,干预组大鼠视网膜GLAST的表达升高(实时荧光PCR法:t=3.56,P＜0.05;Western blot:t=3.52,P＜O.05);视网膜谷氨酸含量下调(t=4.36,P＜0.05).实时荧光PCR法和荧光免疫法检测结果显示,高糖可以降低视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=3.48,P＜O.05;荧光免疫法:t=4.72,P＜O.05);[3H]标记的D,L-谷氨酸摄人量结果显示,高糖可以下调视网膜Mü1ler细胞GIAST的功能(t=3.81,P＜0.05);经PEDF处理后,可以明显改善高糖状态下视网膜Müller细胞GLAST的表达(实时荧光PCR法:t=6.82,P＜O.01;荧光免疫法:t=3.72,P＜0.05)和对谷氨酸的摄取功能(t=4.14,P＜0.05).结论 PEDF可通过改善糖尿病大鼠视网膜Müller细胞中GLAST功能从而改善谷氨酸循环,抑制神经节细胞的死亡.
关键词： 糖尿病视网膜病变/病理生理学 细胞因子类/生理学 谷氨酸/代谢 糖尿病 实验性
