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人脐血中CD133+血管内皮祖细胞的分离培养和生物学特性
目的:观察免疫磁珠法分离得到的CD133+血管内皮祖细胞的细胞表面标记及生物学特性.方法:实验于2002-11/2003-08在解放军第四军医大学西京医院烧伤外科实验室完成.①选取正常顺产或剖腹产人胎盘(解放军第四军医大学西京医院妇产科提供,产妇均知情同意)作为CD133+血管内皮祖细胞的标本来源.②人胎盘脐血ACD-B抗凝,稀释后取7 mL脐血缓慢加入淋巴细胞分离液3 mL,2 100 r/min离心30 min,取棕黄色层低密度单个核细胞,洗涤去血小板.免疫磁珠与FITC-CD133单抗室温孵育30 min,洗去多余单抗,将包被FITC-CD133的免疫磁珠加入到单个核细胞中,室温孵育30 min,置于磁场中1 min,吸弃细胞悬液,加入磁珠-细胞分离液从免疫磁珠上释放出CD133+血管内皮祖细胞.加入EGM-2MV培养基,接种于包被Ⅰ型胶原的培养瓶中,24 h换液除去未贴壁细胞,3 d后半量换液,培养3～4周.③观察CD133+血管内皮细胞经免疫磁珠分离后的形态变化;采用流式细胞仪分析CD133+血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞的比例及免疫磁珠的分离效率;免疫荧光及酶组织化学检测CD133+赢管内皮祖细胞体外培养不同时期的表形变化;透射电镜观察成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况.结果:①CD133+血管内皮祖细胞体外培养形态观察:贴壁小细胞团在4～5 d可见伪足伸出,7 d后呈克隆状迅速生长,2～3周后密集区细胞呈"鹅卵石"样,培养4周融合后的细胞呈梭形.②CD133+血管内皮祖细胞分离率检测结果:CD133+血管内皮祖细胞在脐血单个核细胞中的比例为0.91%,经免疫磁珠分离后比例为85.52%.③CD133+血管内皮祖细胞体外培养不同时期的免疫表形变化:培养第5天极少数细胞CD133染色阳性,大部分细胞CD34及vWF染色阳性;第10天所有细胞CD133染色均呈阴性,大部分细胞CD34、vWF染色呈阳性.④成熟血管内皮细胞W-P小体的形成情况:透射电镜下培养第10天可见成熟血管内皮细胞所特有的W-P小体.结论:采用免疫磁珠法可以有效地从人脐血中分离纯化CD133+血管内皮祖细胞,不同培养时期通过CD133,CD34,vWF单抗以及透射电镜进行鉴定,证明其具有分化为成熟血管内皮细胞的能力.
