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沉默HAX1基因对人骨肉瘤细胞凋亡的影响
目的 观察HS1相关蛋白X-1(HS1-associated protein X-1,HAX1)对骨肉瘤细胞凋亡的影响.方法 应用基因沉默技术在骨肉瘤细胞系MG63中下调HAX1基因的表达,并且通过Western blot实验与免疫荧光实验检测基因沉默效率;应用MTT方法及克隆形成实验,评价沉默HAX1基因对MG63细胞增殖能力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡并通过Western blot实验检测下游蛋白的表达变化.结果 沉默HAX1基因抑制人骨肉瘤细胞系MG63的增殖能力与克隆形成能力,流式细胞技术显示沉默HAX1可以诱导MG63细胞凋亡,Western blot实验说明HAX1诱导的MG63细胞凋亡与caspase3和caspase9蛋白上调相关.结论 HAX1可能是维持骨肉瘤细胞增殖能力的关键基因,沉默该基因诱导骨肉瘤细胞凋亡可能与caspase3/caspase9上调相关.
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桔梗皂苷D对肝癌干细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制研究
目的 探讨桔梗皂苷D对肝癌干细胞活力和细胞凋亡的干预作用及其机制.方法 MTT法和Annexin V染色流式细胞术检测桔梗皂苷D和5-氟尿嘧啶对HepG2肝癌干细胞细胞活力和细胞凋亡的影响;采用Western blot检测HepG2肿瘤干细胞HAX1表达;运用JC-1染色流式细胞术、Annexin V染色流式细胞术及Western blot方法研究桔梗皂苷D联合5-氟尿嘧啶对肝癌干细胞凋亡通路的影响.结果 5μmol/L 5-氟尿嘧啶处理下HepG2肿瘤干细胞活力抑制率为(29.1±2.4)％,显著低于常规HepG2细胞活力抑制率(72.7±5.2)％(P＜0.05).5-氟尿嘧啶联合桔梗皂苷D对HepG2肿瘤干细胞的细胞活力抑制率为(66.7±3.4)％,凋亡诱导率为(33.9±2.1)％,显著高于5-氟尿嘧啶单独处理的细胞活力抑制率[(28.7±1.8)％,P＜0.05]和凋亡诱导率[(8.9±0.6)％,P＜0.05].桔梗皂苷D处理后HepG2肿瘤干细胞HAX1相对表达水平比对照组显著下降[(0.24±0.02)比(0.78±0.05),P＜0.051;5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D+HAX1质粒组HepG2肿瘤干细胞凋亡率显著低于5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组[(10.1±0.7)％比(34.8±2.2)％,P＜0.05];5-氟尿嘧啶+桔梗皂苷D组HepG2肿瘤干细胞相对线粒体膜电位显著低于5-氟尿嘧啶组[(0.21±0.02)比(0.84±0.04),P＜0.05].结论 桔梗皂苷D可能通过下调HAX1表达抑制肝癌千细胞对5-氟尿嘧啶的抵抗性.
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高表达HAX1对人结肠癌细胞SW480凋亡的影响
目的 观察高表达人血细胞特异蛋白1相关蛋白X-1(haematopoietic cell-specific protein 1-associated protein X-1,HAX1)对结肠癌SW480在化疗药物打击后凋亡的影响.方法 构建HAX1高表达的质粒,并瞬时转染入结肠癌细胞SW480中(HAX1组,转染了对照空质粒的结肠癌细胞SW480为CTL组),24 h后加入顺铂(10 μg·mL-1)处理细胞约36 h,用Sub-G1法及Annexin V-FITC流式检测法检测并比较2组细胞凋亡率的差别.同时用Western blot方法 检测转染细胞的HAX1表达情况及凋亡途径相关蛋白caspase-9和PARP的变化.结果 顺铂打击336h后,Sub-G1法显示CTL组平均凋亡率为(33.67±2.50)%,HAX1组诱导凋亡率均值(16.33±2.10)%,比CTL组降低(P=0.026).Annexin V-FITC法检测CTL组凋亡率均值为(46.33±9.30)%,HAX1组凋亡率均值为(24.33±6.10)%.HAX1组比CTL组明显降低(P=0.013).Western blot证实在细胞高表达HAX1蛋白后,可明显降低caspase-9及PARP的剪切体蛋白的表达.结论 高表达HAX1抑制顺铂诱导的SW480细胞凋亡,这种抑制作用是通过降低凋亡途径caspase-9及PARP剪切体表达情况完成的.
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HAX1和EGFP共表达重组腺病毒载体的构建、鉴定
目的 构建和鉴定HAX1和EGFP双基因共表达重组腺病毒载体.方法 采用DNA重组技术,将目的 基因HAX1克隆至含有报告基因EGFP的穿梭质粒pAdTrack-CMV中,并转化于大肠埃希菌DH5α;筛选出重组质粒pAdTrack-CMV- HAX1,并在BJ5183细菌中与pAdEasy-1质粒进行同源重组,产生重组腺病毒载体;用lipofectamine将其转染HEK293细胞,包装携带全长HAX1的重组复制缺陷型腺病毒pAd-HAX1-EGFP,酶切和序列测定鉴定;用制备好的Ad-HAX1-EGFP感染HEK293细胞,流式细胞术检测其感染效率,RT-PCR、Western 印迹鉴定外源基因HAX1的表达.BrdU检测感染了Ad-HAX1-EGFP的HEK293细胞增殖情况.结果 pAdTrack-CMV-HAX1重组质粒构建成功.pAdTrack-CMV-HAX1 质粒与pAdEasy-1质粒同源重组后与预期结果相符.构建好的Ad-HAX1-EGFP能有效感染HEK293细胞;外源基因能在239细胞中有效表达.HAX1高表达的HEK293细胞其增殖率得以提高.结论 成功构建了表达HAX1和EGFP共表达的重组腺病毒载体,HAX1能够促进结肠癌细胞HEK293细胞的增殖.
