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百优解联用雌激素对大鼠慢性不可预见应激模型更年期抑郁症5-HTRIA mRNA转录功能的影响

时间:2020-02-20 09:57:39 来源: 浏览:66

  百优解联用雌激素对大鼠慢性不可预见应激模型更年期抑郁症5-HTRIA mRNA转录功能的影响

  刘洪秋,杨建立,刘丹丹,韩超天津医科大学天津安宁医院,天津300000

  关键词:更年期抑郁症模型;百优解;雌激素;5-HTRIA mRNA

  中国图书分类号:R332文献标识码:A文章编号:1001-4411( 2018) 13 -3063 03;doi:10. 7620/zgfybj.j issn.1001-4411. 2018.1 3.62

  随着社会各种应激因素的加大,加之退休年龄延迟,使更年期抑郁症发病率呈逐年升高趋势,但由于目前临床尚无有效抗抑郁药物,故而,探索有效干预药物是现今需要解决的难题之一。现今由于本病的发病机制错综复杂,目前5 -HT能假说,以其5-HT可较好的调节心境及行为而受到公认。5-HT受体基因中含量最丰富的是5 -HTRIA,已有研究证实,海马5-HTIA作为突触后受体,根据受体结合情况,在重症抑郁症患者中呈现下降趋势,而治疗后则出现逆转口o,由此推测,抑郁症的改善可能与海马突触后5 -THIA受体活化有关,同时,更年期抑郁症的治疗,临床多采用百忧解以及可以改善性激素水平尤其是雌激素水平有关的药物。故而,本研究在综合文献研究假说的基础上,以5 -HTRIA为切人,大鼠慢性不可预见应激模型为研究对象,从分子水平进一步探讨百优解联用雌激素对更年期郁症的影响。

  1材料与方法

  1.1 实验动物正常饲养1周后,选择旷场实验评分接近、体重接近-的大鼠40只,Wistar清洁,体质量(180+20)g,实验大鼠均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

  1.2 实验分组与给药方法按照随机数字表法对实验大鼠进行随机分组,即:假手术组(1组)、更年期组(2组)、更年期抑郁症模型组(3组)、西药组(4组),每组各10只,其中1组、2组与3组,每天早上8:00予以蒸馏水,剂量为10 mg/kg/d,4组予以百忧解混悬液(生产厂家:Eli Lilly and CompanyLimited;批准文号:国药准字A 140885;剂量:4 mg/kg/d),并苯甲酸雌二醇(生产厂家:天津金耀氨基酸生产有限公司;批准文号:国药准字0505111;剂量:0.2 mg/kg)肌注,隔日1次。

  1.3动物造模方法 手术造模开始前1 d禁食,根据不同方法进行造模:去势:行卵巢摘除术,腹腔注射麻醉采用10%水合氯醛(300 mg/kg体重),固定大鼠后,根据结扎大鼠步骤进行双侧卵巢减除,阴道涂片于术后1周进行,监测未见动情周期,若连续5d未见,则证明去势成功。假手术组:方法同“去势”,仅结扎、并摘取卵巢附近少许脂肪组织,手术过程中不切除卵巢。慢性不可预见性应激处理4{,:将大鼠每笼1只进行孤养饲养,并以7d为’1个周期,进行不可预见性刺激,连续21 d,每日随机选取电击足底、冰水游泳、热应激、摇晃、夹尾、禁水(24 h)、禁食(48 h)和昼夜颠倒等8种刺激中的1种进行。

  1.4主要试剂及仪器

  1.4.1 试剂 ImProm -II反转录酶、dNTP、随机引物pd (N)6均购自美国Promega公司;Taq DNA聚合酶、水饱和酚等均购自北京鼎国生物技术有限公司;异硫氰酸胍等购自美国Simga公司。

  1.4.2仪器 紫外分光光度计(生产厂家:德国Eppendorf公司,型号:BioPhotome -term);PCR扩增仪(生产厂家:杭州大和热磁有限公司,型号:TH-48a);全自动凝胶图像分析系统(生产厂家:上海天能科技公司,型号:GIS-2010)。

  1.5指标检测及方法采用RT-PCR法检测大鼠不同脑组织(海马和皮质神经元)中5 -HTRIA mRNA的转录水平,按照引物设计原则及所需实验条件设计引物,本研究主要由上海生物工程有限公司进行全部引物合成,该软件主要由GeneTank序列编辑Primer引物设计(引物序列见表1),而后按照Promega的RNAgent、总RNA提取试剂盒步骤进行RNA提取,RNA浓度由紫外分光光度计检测,进行逆转录反应、PCR扩增(反应条件见表2),最后采用琼脂糖凝胶上电泳,染色,采集图像应用凝胶图像分析系统,同时进行灰度值读取、分析。

  1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0进行数据分析,其中计数资料用%表示,采用X2检验;计量资料用均数±标准差(x+s)表示,采用£检验,P

  表1引物序列、位置和扩增片段长度

表1引物序列、位置和扩增片段长度

  表2 PCR反应条件

表2 PCR反应条件

  2结果

  2.1 大鼠情况分析 经过造模后,共计死亡大鼠4只,其中假手术组1只、更年期组1只、更年期抑郁症模型组2只,剩余36只。经过解剖分析,未见异常。

  2.2 5 -HTRIAmRNA的半定量RT-PCR分析

  2.2.1 海马部位5 -HTRIAmRNA转录水平分析 与1组比较,2、3、4组的5 -HTRIAmRNA转录水平均降低明显,差异有统计学意义(均P0.05);与3组比较,4组的5 -HTRIAmRNA转录水平增加明显,差异有统计学意义(P<0.01)。结果见表3、图2,其中图2为分析5-HTRIA在各组间的不同表达,以图1的管家基因G3PDH为参照。

  表3海马部位5-HTRIAmRNA转录水平分析

表3海马部位5-HTRIAmRNA转录水平分析

  注:与1组比较,a.P<0 01,与3组比较,(1.P

图1 G3PDH基因RT-PCR产物电泳吲

  注:M代表DNA分子量标准,1-6是4组,即西药组;7-12模型组是3组,即更年期抑郁症模型组;13-18是2组,即更年期组;19 -24是1组,即似手术组。

  图1 G3PDH基因RT-PCR产物电泳吲

图2 5_H'l'RIAmRNA基因R'l'_PCR分析RT-PCR产物电泳图

  注:M代表DNA分子量标准,1-6是4组,即西药组;7-12模型组是3组,即更年期抑郁症模型组;13 -18足2组,即更年期组;19 -24是l组,即假手术组。

  图2 5_H'l'RIAmRNA基因R'l'_PCR分析RT-PCR产物电泳图

  2.2.2皮质部位分析见表4、图3、图4。

  表4皮质部位5_H'11RIAmRNA转录水平分析

表4皮质部位5_H'11RIAmRNA转录水平分析

  注:与1组比较,a.P<0. 01;与2组比较,b.P<0.01,(-P>0. 05:与3组比较,d.P

  与l组比较,2、3、4组的5-HTRIAmRNA转录水平均降低明显,差异有统计学意义(均P0.05);与3组比较,4组的5 -HTRIAmRNA转录水平增加明显,差异有统计学意义(P<0.01)。图3为分析5-HTRIA在各组间的不同表达,以管家基因G3PDH为参照。

图3 C3PDH基因RT-PCR产物电泳图

  注:M代表DNA分子量标准,1-6是4组,即西药组;7-12模型组是3组,即更年期抑郁症模型组;13 -18是2组,即更年期组;19 -24是1组,即似于术组

  图3 C3PDH基因RT-PCR产物电泳图

图4 5-HTRIAmRNA基因RT-PCR分析RT-PCR产物电泳图

  注:M代表DNA分子量标准,1-6是4组,即西药组;7-12模型组足3组,即更年期抑郁症模型组;1 3 -18是2组,即更年期组;19 -24是l组,即假于术组

  图4 5-HTRIAmRNA基因RT-PCR分析RT-PCR产物电泳图

  3讨论

  更年期抑郁症多发生在中年至老年的过渡期,多是由于心境加之年龄,以及女性生理周期的变化而导致,西医学虽对本病机理尚未完全阐明,但大多认为与5-HT能低下有关b1,然而,随着研究的深入,前述理论对于药效延迟较难解释,即服药后中枢神经系统5-HT浓度快速升高,但2~3周后临床疗效才能显现[6],从而提示我们,突触前后的5-HT系统,在抑郁症状改善之前可能存在长时间适应性改变一3,而该因子浓度的增加或许只是发挥抗抑郁作用的初始环节,据此推测,抑郁症状的改变可能与5-HT受体的负反馈调节有关。

  更年期抑郁症发病机制的研究,主要停留在认识阶段,主要与5-HT、肾上腺素受体、多巴胺等单胺递质相对应的受体有关,认为5-HT受体至少存在7种亚型,且每个受体又各自存在若干亚型,在抑郁症发病中占据重要地位旧1,研究者进一步研究发现,抑郁症患者的大脑结构和功能损害,可能与患者在受到急慢性应激刺激后,相关脑区的5-HTIA受体mR-NA表达降低有关,而海马作为高位调节中枢,亦是受应激累及的最敏感区域,其富含5 -HTIA受体,故而在抑郁症的发病机制研究中,多对于海马投入较大关注。

  本研究即以此为切人点;以更年期抑郁症大鼠模型为研究对象,主要采用去势+孤养+改良的慢性不可预见应激方法复制模型,以百忧解结合雌激素进行干预,观察海马、皮质中的5 -HTRIA mRNA表达变化,结果发现慢性不可预见应激模型更年期抑郁症中存在5 -HTRIA mRNA转录异常的现象,百优解联用雌激素可逆转此现象,该结果与相关文献报道相契合,国外研究发现旧1对于抑郁症患者而言,尤其是重度或者已有自杀倾向者,经检测存在突触后5-HTRIA受体mRNA减少的现象,调节5-HTIAR转录水平,可干预抑郁症的报道。可见,慢性应激所致抑郁症的发生发展与5 -HTRIA mRNA转录水平密切相关,但其具体作用机制如何,尚待进一步研究发现。


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