RT-PCR引物设计需要遵循的主要原则有：

　　(1)引物应在核酸保守区内设计并保持特异性;

　　(2)引物长度一般为15-30bp, GC含量一般为40%-60%;

　　(3)引物模板序列的Tm值要保持在72℃左右;

　　(4)引物3’端的碱基满足四“不”：一“不”：不用A，二“不”：不出现3个以上连续碱基(如GGG和CCC)，三“不”：不要互补、二聚体或发夹结构，四“不”：不能终止于密码子的第3位;

　　(5)碱基随机分布，禁止引物自身和引物之间连续4个碱基互补;6、引物的3’端ΔG值低，5’端和中间ΔG值高，呈正弦曲线形状。

　　PCR引物设计常用软件有“Oligo”、 “DNAstar”、 “Primer premier”等，操作相对复杂，对于刚入门的科研小白来说很难上手。

　　今天给大家介绍一种适合新手的引物设计方法，非常适合刚入门的新手使用。

       网站1：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/

       网站2：https://www.sangon.com

       打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，点击All Databases下拉选项，选择Gene。

　　在框内输入目的基因(以Akt为例)，搜索Akt如图，可以看到显示好多Akt基因，选取对应品种，如小鼠(house mouse)、大鼠(Norway rat)、人(human)等，这里需要选取小鼠(house mouse)品种的Akt。

　　打开Akt1，下拉网站，选择NCBI Reference Sequences (RefSeq)中的mRNA and Protein(s)，点击NM_001165894.1，复制Akt1的基因序列。

　　如何进行引物设计?

       打开https://www.sangon.com(生工官网)，点开技术服务，点击在线免费引物设计，将前面复制的基因序列拷贝到其中，按照提示要求进行勾选(以小鼠的Akt基因为例，如下)，提交引物设计单子。

　　如何查看引物设计结果?

      点击引物设计列表，查看结果即可看到Akt基因设计的引物，在进行引物合成之前，我们还需要对设计得到的引物进行BLAST验证，通过软件模拟，观察其是否能够扩增出我们的目的基因。

　　如何进行引物的BLAST验证?

       打开https://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站，下拉，点击Primer-BLAST，拷贝前面设计好的引物，更改Organism选项为house mouse (taxid:10090)(根据品系选择，本例中为小鼠品系)，后点击Get Primers进行BLAST验证(结果需要等待几秒)，观察结果，如果验证所得基因为Akt，即设计出来的引物符合要求，可用于进行PCR实验。

　　以上就是利用https://www.ncbi.nlm.nih.gov/和https://www.sangon.com/两个网站进行引物设计的步骤，是不是很简单呢?希望对刚进实验室的小伙伴们有帮助!