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1  仪器与试药
  高效液相色谱仪:Waters600E泵,WatersPAD996二极管阵列检测器;旋转蒸发仪(SB–1000,N–1000,日本东京理化株式会社);紫外分光光度仪(UV–2501PC,日本Shimadzu公司);电子分析天平(UV120D,日本Shimadzu公司)。高效液相色谱用试剂:甲醇(色谱纯),水(三蒸水),三氟乙酸(分析纯);没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所,批号:110836-200302、110648-200318、110754-200307)。实验室用药材,由沈阳药科大学中药教研室孙启时教授鉴定为蜂房(Nidus Vespae)。
  2  方法与结果
  2.1  色谱条件色谱柱为Kromasil ODS-C18(250 mm×4.6 mm,5 μm);流动相为甲醇(A)?水(三氟乙酸调pH至5)(B);梯度洗脱程序:0 min (0% A),15 min (8% A),18 min (12% A),30 min (15% A),45 min (18% A);体积流量:1.0 ml/min;检测波长254 nm;柱温25℃。色谱图见图1。
  2.2  供试品溶液的制备称取剪碎的蜂房药材(辽宁沈阳)2 g,用20倍水煎煮3次,水煎液用滤纸过滤,所得滤液浓缩至约10 ml;将浓缩液醇沉12 h,之后过滤得醇沉液;醇沉液减压浓缩至无醇味,用水25 ml分次定量转移至分液漏斗中,正丁醇等体积萃取3次,萃取液合并,旋转蒸发至干,用甲醇溶解并定容至10 ml容量瓶中,微孔滤膜过滤,取续滤液作为供试品溶液。
  2.3  对照品溶液的制备精密称没食子酸对照品8.0 mg、对羟基苯甲酸对照品7.6 mg和原儿茶酸对照品11.1 mg,分别置于10 ml容量瓶中,用甲醇溶液并稀释到刻度,摇匀即得,作为对照品储备液。分别精密吸取上述贮备液1.0 ml,置同一10 ml量瓶中,用甲醇溶液并稀释到刻度,摇匀即得,作为对照品溶液。
  2.4  线性关系的考察 精密吸取对照品溶液0.04,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.5,1.8 ml,分别置于2 ml量瓶中,用甲醇溶液并稀释到刻度,摇匀,分别进样5 μl。以各成分峰面积为纵坐标(Y),质量浓度为横坐标(X),绘制标准曲线,计算回归方程:Y没食子酸=8.97×106X+7 317.1, r=0.999 6,线性范围1.6~72.0 μg/ml;Y对羟基苯甲酸=1.95×107X-73 247,r=0.999 5,线性范围1.52~68.4 μg/ml;Y原儿茶酸=5.01×107X-169 012,r=0.999 8,线性范围2.22~99.9 μg/ml。精密度实验取同一供试品溶液,分别连续进样6次,测定没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积,结果RSD分别为0.41%,0.56%和0.72%,均小于2%,表明仪器精密度良好。
  2.5  重复性实验取同一批蜂房样品6份(辽宁沈阳),按供试品溶液的制备方法制备成6份,分别进样5 μl,结果,没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸峰面积的RSD分别为0.83%,0.74%和0.95%,均小于2%,表明方法重复性良好。稳定性实验取同一供试品溶液,分别于0,2,4,6,8,24 h进样5 μl。结果,没食子酸、对羟基苯甲酸、原儿茶酸的峰面积的RSD分别为1.72%,1.61%和2.19%,均小于5%,表明供试品溶液在24 h内稳定。
  2.6  回收率实验精密称取6份已知含量的辽宁沈阳蜂房(没食子酸含量0.256 mg·g-1,对羟基苯甲酸0.365 mg·g-1,原儿茶酸0.327 mg·g-1)1 g,分别加入没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸对照品溶液适量,按;2.2”项下操作,计算回收率。结果没食子酸平均回收率98.9%,RSD=1.01%;对羟基苯甲酸平均回收率98.4%,RSD=1.18%;原儿茶酸平均回收97.3%,RSD=1.18%。不同产地样品测定分别取不同产地的蜂房1 g,按照;2.2”项下方法制备供试品溶液,分别进样5 μl,测定峰面积,根据标准曲线计算样品中没食子酸、对羟基苯甲酸和原儿茶酸的含量。
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