本文是一篇专业的医学论文，主要是关于骨肉瘤分子诊断标志物的研究进展，详情请看下面的介绍。

　　1 引言骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤，五年生存率低，好发于青少年，是严重影响青壮年健康的恶性肿瘤之一。2O 左右的骨肉瘤病例在确诊时已出现肺内转移，因此，早期诊断对骨肉瘤的治疗及预后均非常重要，只要及早诊断，术前仔细分型，细心手术加上术前和术后的化疗，则预后大为改观，五年治愈率有明显提高。目前还未发现既特异又敏感的骨肉瘤标志物。事实上，骨肉瘤在细胞形态发生明显变化之前，其分子水平及生化代谢水平已发生异常改变，出现功能异常的癌基因产物，如P16，Survivin等。随着分子生物学和基因组学研究的不断深入，人们对骨肉瘤的发生机制在分子水平上对它的发生、发展、转移和预后有了一定的认识，并取得一定的成就。现将研究的比较热门的几种骨肉瘤分子诊断标志物进行综述，以期对骨肉瘤的早期诊断有所帮助。

　　2 骨肉瘤分子诊断标志物

　　2．1 Snail Snail是一种锌指蛋白转录因子，因其高表达与许多肿瘤有关而备受关注。脊椎动物的Snail家族包括两个成员，即Snaill和Slug，后者又可称为Snail2。Snail蛋白通过与Smad相互作用蛋白(smadinteracting protein一1，SIP1)竞争性结合Ecadherin启动子区的Ebox序列，抑制E-cadherin，occludin等的表达，上调FSP1，vimentin和Rho等的表达而提高细胞侵袭、转移能力，所以，Snail蛋白可以被看作肿瘤转移的促进因素。

　　Sharili等[1 发现，Snail2蛋白在骨肉瘤中表达与肿瘤的分级呈正相关，分化程度越差、恶性程度越高的肿瘤Snail2蛋白表达越高。Snail2可活化EMT而直接抑制细胞黏附分子E-eadherin使得肿瘤细胞更易发生转移。由于犬骨肉瘤基因与人骨肉瘤基因极其相似，他们通过建立犬骨肉瘤模型证实肿瘤细胞的转移还与肿瘤的来源密切相关，如头骨骨肉瘤细胞中Snail2虽呈高表达，而其转移率却甚低。所以判断骨肉瘤转移情况，需同时依靠Snail蛋白的表达程度及骨肉瘤具体来源。程中衡等口 用脂质体转染法将高转移性骨肉瘤细胞株MG一63分别转染反义Snail质粒(pGenesilsnailAS)和空载体质粒(pGenesil)，转染后的反义Snail组细胞Snail表达被有效沉默，抑制了MG一63细胞生长，原因可能与细胞周期受到阻滞有关。实验中还发现，高转移性骨肉瘤细胞株MG一63能表达较高水平的Snail，用反义Snail技术阻滞其Snail表达后，穿过屏障的MG一63细胞明显减少，细胞的运动能力明显下降，证明MG一63细胞侵袭能力受到抑制，提示Snail参与了介导MG一63细胞侵袭行为的重要环节，抑制Snail表达能抑制MG一63细胞的侵袭能力。总之，Snail蛋白在骨肉瘤的发生、发展和浸润、转移中起重要作用，而Snail在正常成人大多数细胞类型并不表达，故检测Snail蛋白在骨肉瘤组织中的表达有助于评估患者肿瘤的恶性程度，也为区别良恶性骨病及判断骨肉瘤预后情况提供依据。针对异常表达的Snail进行干预，可以抑制骨肉瘤的转移，增加药物化疗敏感性，有可能为临床骨肉瘤的治疗提供新策略。

　　2．2 MICA MHCI类链相关蛋白A(MICA)基因位于人类HLA基因位点内，属于I型跨膜蛋白。

　　MICA蛋白是人类免疫细胞表面NKG2D受体的主要配体，在恶性转化的细胞中常过表达，并和免疫细胞表面的NKG2D受体结合，激活免疫细胞对转化细胞的细胞毒作用，在肿瘤免疫中起免疫监视作用和免疫逃避作用。MICA的表达对NK 细胞介导的细胞杀伤作用更加敏感，对肿瘤细胞起免疫监视作用。然而肿瘤可通过一系列机制下调NKG2D表达，抑制NK细胞活化受体的功能，从而逃脱免疫系统的监视，许多肿瘤细胞释放的可溶性MICA(sMICA)可抑制NKG2D功能，此时MICA对肿瘤细胞起免疫逃避作用。这可能与肿瘤的恶化有关。

　　卢善明等研究的结果显示MICA蛋白在骨肉瘤组织的表达率为51．6%，在骨母细胞瘤的表达率为9．1%，而在骨化性纤维瘤和正常骨组织几乎不表达，这提示MICA 可作为骨肉瘤诊断的分子标志物，MICA 表达上调可能与细胞恶性转化有关。Holdenrieder等的研究也有相似结果，他们发现正常人的sMICA显着低于良性疾病和恶性患者，良性疾病明显低于恶性患者，而且恶性患者sMIcA高低与疾病发展阶段呈正相关，与肿瘤转移程度也密切相关。Rebmann等[5 进一步通过ELISA法测定多发性骨髓瘤患者血清中sMICA后发现，肿瘤患者血清中含量明显高于正常人，血清中含量高于305 pg／ml患者的完全生存率与无进展期生存率要低于含量小于305 pg／ml的患者，因此sMICA可以作为衡量患者完全生存率及无进展期生存率的独立预后因素。

　　2．3 RASSF1A基因 RASSF1A基因是2000年Dammann等利用酵母双杂交筛选方法在3p染色体等位基因缺失区克隆出的一个与鼠的RAS效应蛋白Norel和Maxpl高度同源的cDNA，并命名为RAS相关区域家族1基因(RASSFIA 基因)。

　　RASSFIA基因能编码由340个氨基酸组成、相对分子质量为38．8 kD的蛋白质，其N末端与富含半胱氨酸的甘油-fib或佛波酯结合区高度同源，亦称作蛋白激酶C保守区1(PKCC1)。目前认为，RASSFIA蛋白可能是一种参与细胞周期调控的重要抑制蛋白，其通过多种途径抑制细胞生长、促进细胞凋亡和衰老，RASSF1A蛋白表达缺失或降低则可导致肿瘤的发生。

　　高甲科等 采用免疫组化法检测骨肉瘤患者RASSF1A蛋白的阳性率(45．7%)显着低于对照组(95．0%)，RASSF1A 蛋白和Cyclin D1蛋白在骨肉瘤中的表达呈负相关，说明RASSF1A失表达与Cyclin D1过表达在骨肉瘤的发生、发展中可能具有协同作用，从而促使肿瘤细胞更具恶性显型。

　　刘之川等实验研究得出RASSFIA基因的表达与肿瘤的Enneking分期及是否发生远处转移相关，而与患者的年龄、性别、肿瘤的部位及大小、Price组织学分级及是否侵犯软组织无关。章振华等L8]通过观察骨肉瘤组织中RASSFIA基因启动子区域的甲基化状态发现RASSF1A基因甲基化是一种普遍事件。由于基因甲基化是不改变基因结构的可逆过程，通过药物可去除甲基化、恢复基因的原有功能。因此，RASSF1A表达缺失为骨肉瘤临床早期诊断、发展转移以及预后分析提供帮助，该基因甲基化的研究，有望为其治疗提供新方法。

　　2．4 HER一2 人类表皮生长因子受体2(HER一2)是表皮生长因子受体家族的一员，其基因为cerbB-2基因，定位于染色体17@221．32上，编码相对分子质量为185 000的跨膜受体样蛋白，具有酪氨酸激酶活性，无可溶性的配体，因此又称;孤儿受体”，具有转移启动子的作用，它通过激活P13K／Akt生存通路使癌细胞增殖活性增高，凋亡受到抑制，从而获得较强的生长优势。正常细胞表面几乎不存在HER一2，而腺癌细胞膜往往出现HER一2过表达，并且肿瘤细胞表面HER一2表达越强，肿瘤的恶性程度越高，越容易转移。

　　马琼等研究结果显示，在恶性程度较高的骨肉瘤患者中有55．3 HER一2表达阳性，而在稳定的骨肉瘤细胞系中，HER一2的表达也高达42．9%。

　　其表达还与骨肉瘤的临床分期有关，这与国外其他学者研究结果基本相同。Bianeo的研究表明，HER一2过表达和活化后，可以启动P13 K／Akt信号转导通路，并且P13K／Akt信号转导通路在肿瘤细胞恶性增殖、血管生成和转移以及对放化疗的拮抗中起着重要作用。也有报道指出，骨肉瘤患者中HER一2过度表达，可促进机体中的金属基质蛋白酶(MMPs)的分泌，降解细胞外基质和基底膜，增强瘤细胞的浸润能力，它与整合素~6134相互作用可使细胞内肌动蛋白重组，促进肿瘤细胞运动，并上调肿瘤细胞的VEGF表达，增强肿瘤细胞与内皮细胞黏附，从而诱导血管生成和血管植入，促进骨肉瘤的转移。目前已有许多国内外学者也做了相应的研究，他们选择性的应用HER-2抑制剂于体外实验并取得了一定的成果，他们发现选择性的HER一2抑制剂在骨肉瘤的预防、增强化疗、放疗的敏感性，减少其毒副作用方面都有潜在的应用价值。上述资料表明HER一2过表达可能预示着骨肉瘤发生转移且预后不良。但是目前对HER一2抑制剂是否能作为骨肉瘤的新药物还不十分完善，有待进一步的研究和验证。

　　2．5 MMP一2／MMP-9 MMP-2和MMP～9属于基质金属蛋白酶类(MMPs)中的明胶酶类，明胶酶是唯一能降解Ⅳ型胶原三螺旋部位的酶，在肿瘤侵袭转移中占重要地位。明胶酶能降解含有胶原的基底膜，使其失去完整性，同时能降低细胞的黏附性，促进恶性肿瘤新生血管的形成，使肿瘤细胞易于游走，加速肿瘤的生长和转移。因此，可以认为MMP一2和MMP一9是介导肿瘤恶性生长过程的重要物质口 ，可能与恶性肿瘤的生长和转移有密切的关系。

　　MMP一2和MMP-9在很多恶性肿瘤和一些心血管疾病中表达。唐昭军等研究显示，MMP一2在骨肉瘤中的阳性表达率为63．3 ，MMP一9在骨肉瘤组织中的表达为88．9 ，证明MMP一2和MMP-9在骨肉瘤中表达明显升高。傅培荣等通过临床研究，其结果也表明MMP-2和MMP一9在骨肉瘤中表达明显升高，实验中他们还得出MMP-2和MMP一9阳性表达的骨肉瘤转移率明显高于其阴性表达的骨肉瘤，提示MMP一2和MMP一9与骨肉瘤的侵袭转移能力呈正相关，进而提示MMP一2和MMP一9阳性表达的骨肉瘤其早期转移和侵袭的可能性较大，尤其是肺部的转移，预后较差。临床检测MMP一2和MMP一9可能是预测肿瘤恶性行为的有用指标。

　　2．6 ckit基因 ckit基因位于人染色体4ql112，其表达产物c-kit受体又称CD117蛋白、干细胞因子受体(SCFR)，是由ckit原癌基因编码的具有酪氨酸激酶活性的跨膜蛋白受体。当ckit受体活化，可激活酪氨酸激酶信号传导通路，促进细胞增殖、生长分化。目前，c～kit基因已被证实在多种肿瘤均有表达，其受体的异常激活也和骨肉瘤密切相关。

　　Luciana等的研究显示，对骨肉瘤患者进行免疫组化检测，c-kit基因阳性表达率为46．2 ，高表达病例对化疗反应不佳，在骨纤维结构不良组织中呈弱表达，提示ckit可作为骨肉瘤的恶性表型标志。魏红等的实验也得到了相似的结果，并且通过随访普通型骨肉瘤患者及其生存分析得出ckit高表达者更易局部复发，术后生存时间显着低于c-kit低表达组，揭示ckit与普通型骨肉瘤的复发、预后有密切的相关性。实验中还发现c-kit外显子的突变在骨肉瘤中是低概率事件，不是引起ckit过表达的主要原因，所以不能为酪氨酸激酶抑制剂的治疗提供靶点。c-kit基因表达在骨肉瘤中扮演重要角色，从发病机制、诊断、复发到预后贯穿于骨肉瘤研究的始终。不过由于肿瘤发生的多样性、表型的不稳定性及肿瘤预后的复杂性，ckit基因表达与骨肉瘤的生物学行为及诊治等各个方面的关系还有待进一步深入研究。

　　2．7 NF-~B NFKB为一个转录因子蛋白家族，包括五个亚单位，两个亚基形成的同源和／或异源二聚体与靶基因上特定的序列(一姻 位点)结合调节基因转录，不同的NF-~B二聚体在选择结合序列时可能略有差异，这是NF-~B通过不同的二聚体的形式对不同基因的表达进行精细调节的一种方式。NF-B活化后既有促凋亡作用，又有抗凋亡作用。一方面NF-xB通路活化可上调促凋亡蛋白的表达，进而促进细胞凋亡；另一方面，NF一船活化后还可以上调抑凋亡蛋白的表达，进而抑制细胞凋亡。同时也有文献资料显示NF-~B的激活伴有许多与肿瘤浸润、转移相关的重要因子的活化，如基质金属蛋白酶(MMP)、尿激酶型血纤维蛋白溶酶原激活物(uPA)、血管内皮生长因子(VEGF)、细胞间黏附分子(ICAM，VCAM)和内皮细胞选择素(Eselectin)等。这表明NF～JcB的激活可能与肿瘤的生长、浸润和转移有密切联系。

　　高大新等做了NF-xB在骨肉瘤组织中表达的相关研究，实验结果显示NF-~B p65亚单位在正常骨组织和良性骨软骨瘤组织中无表达，但显着表达于骨肉瘤细胞中，在普通中心型骨肉瘤中的表达率也显着高于骨内高分化组，这说明肿瘤细胞中NF B的活化程度还可能影响骨肉瘤的恶性进展。同时他们还发现，在骨肉瘤细胞中存在cyclinD1蛋白高表达，提示肿瘤细胞处于高度分裂增殖状态，并认为NF-xB是通过上调cyclin D1表达，直接作用于细胞周期，刺激细胞异常增殖。

　　NF一 B除了能刺激细胞异常增殖，还与肿瘤的转移等有关。在对大肠癌和骨肉瘤的研究中发现，N卜JcB的表达明显增高，对VEGF有直接正向调节作用，影响肿瘤血管的生成。在具有转移趋向的肿瘤组织中发现VEGF表达的增高导致血管形成加剧，出现大量结构和功能异常的肿瘤血管，如基膜缺乏、管壁不完整等，此时肿瘤细胞极易脱离母瘤进入血液，形成转移。因此，通过检测NF B，可以对骨肉瘤的发生、发展转移、浸润提供一定的客观依据。

　　2．8 miRNA microRNA(miRNA)是近年来发现于真核细胞中的一类内源性非编码小分子RNA，它在调控基因的转录和蛋白翻译中发挥重要的作用，是近年来生命科学的研究热点，人类miRNA通过调控其靶基因的表达及相关信号通路，在肿瘤的发生、发展和转归过程中发挥重要作用Ll 。miR一124属其中一种，肝癌和髓母细胞瘤组织中miR-124的表达下调及其作用机理已得到较为深人的研究。唐志斌等 叩研究显示miR一124的模拟物及抑制剂可分别抑制和促进人成骨肉瘤MG一63细胞生长增殖活性，提示miR一124可能作为抑瘤基因miRNA 参与成骨肉瘤的发生发展。

　　而miR-124并非骨肉瘤中唯一异常表达的miRNA，Lulla等利用TaqMan探针筛选了miR一135b基因，他们的实验同时检测出miR一135b在骨肉瘤中的表达比正常骨组织高22倍，高表达的miR一135b导致骨组织矿化异常，即miR一135b的高水平抑制正常干细胞分化成骨，这或许可以解释骨肉瘤细胞的异常生长。上述研究表明，若miRNA的靶基因是癌基因，此miRNA的表达高于正常水平，也意味着它增加了癌基因的活性，引起癌基因编码的蛋白增加，导致肿瘤发生；反之，若miRNA的靶基因是抑癌基因，miRNA 的表达低于正常水平，引起抑癌基因编码的蛋白减少，后者对癌基因的抑制作用减弱，也会导致肿瘤发生。针对不同靶基因的miRNA建立行之有效的检测手段以及靶向治疗策略，对阐明成骨肉瘤发生发展的分子机制、骨肉瘤的早期诊断、治疗方案选择、疗效评价以及预后判断具有重要意义。

　　3 总结与展望 综上所述，骨肉瘤是常见的骨原发性恶性肿瘤，具有高度恶性、血运丰富、高转移率、预后差等特点，临床上如何进行早期诊断、准确确立安全的治疗方案及判断预后和复发情况，显得尤为重要。目前发现的骨肉瘤相关标志物已有十多种，却无一种敏感性和特异性均能达到诊断和监测的要求，单项指标的检测有一定局限性，由此会引起部分患者的漏诊和误诊。临床上仍然以组织病理学作为骨肉瘤诊断的;金标准”，上述八种骨肉瘤分子诊断标志物在其他某些恶性肿瘤中也有异常表达，开展骨肉瘤分子诊断标志物的检测，结合组织病理学诊断有助于肿瘤的早期诊断，对治疗及预后判断，以及对骨肉瘤发生的分子机理研究有重要意义。唐昭军等实验证实P53、MMP一2和caveolin蛋白在骨肉瘤组织中均呈高阳性表达，且三者的阳性表达率可能存在相当密切的关联性，通过对三者的联合检测，对提高骨肉瘤早期诊断率、判断预后有重要作用。其他两种或两种以上骨肉瘤相关标志物的联合检测，有待进一步深入研究。

　　随着科技的发展，骨肉瘤研究者将借助基因微阵列和生物质谱等新技术，探讨骨肉瘤这类多基因、多蛋白参与的复杂过程，不断发现新的肿瘤分子标志物，为解释骨肉瘤的发生发展提供理论依据，为临床的诊断和治疗开辟新思路。