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影响微球药物释放因素的研究
目的观察影响微球药物释放的因素,为其应用提供理论基础.方法以可生物降解的聚乳酸-聚乙醇酸共聚物(PLGA)和聚L-乳酸(PLLA)为载体,采用乳化-溶剂挥发法制备含细胞松弛素B (cyto B)微球,以HPLC测定cyto B含量.结果制备了不同球径的微球,其球径分别为150 nm、500 nm、1 μm、5 μm、10 μm和20 μm.体外释放实验证明,球径越小,药物释放速度越快;球径相同时,以PLLA为基材的微球比PLGA的释放慢.结论可通过选择适当的微球大小和基质材料达到所期望的药物释放过程.
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细胞松弛素B在人类体外成熟卵子冷冻中的作用
目的:探讨细胞松弛索B在人类体外成熟卵子玻璃化冷冻中的作用.方法:收集常规胞浆内单精子显微注射-胚胎移植(ICSI-ET)周期中未成熟卵母细胞234枚(包括生发泡期即GV期和第1次减数分裂中期即M I期),在体外培养24～48 h,181枚卵母细胞成熟(排出第2极体),随机分成3组并行玻璃化冷冻.A组(43枚)用细胞松弛素B(CB)预处理30 min后行玻璃化冷冻;B组(66枚)用CB预处理20 min后行玻璃化冷冻,C组(72枚)未用CB预处理直接行玻璃化冷冻.D组为对照组30枚体内成熟卵子未用CB处理直接玻璃化冷冻.各组卵子冷冻3周后解冻,复苏的卵子行ICSI辅助授精,观察各组成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率.结果:冻融后的体外成熟卵子,其成活率、受精率、卵裂率及囊胚形成率均显著低于体内成熟卵子(P＜0.05).A组的成活率显著低于B、C两组(P＜0.05),A、B、C 3组间的受精率、卵裂率差异无统计学意义(P＞0.05),A、B两组未获囊胚,C组仅有1枚囊胚.结论:冻融体外成熟卵子,成活率、受精率、卵裂率均下降,囊胚形成率低,胚胎后期发育潜能显著降低.CB预处理未能提高卵子冷冻的成活率、受精率、卵裂率及胚胎的发育潜能.
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小鼠孤雌胚胎干细胞系的建立及生物学特性鉴定
目的:探讨建立合适的小鼠孤雌胚胎干细胞建系方法.方法:采用氯化锶联合细胞松弛素B激活B6D2F1杂交小鼠卵母细胞,所获得的囊胚与桑椹胚分别用于孤雌胚胎干细胞的建系,观察两者的建系成功率.结果:共建立了12株小鼠孤雌胚胎干细胞系,这些细胞SSEA-1抗原阳性,SSEA-4,TRA-1-81,TRA-1-60表面抗原阴性,具有AKP活性,保持正常染色体核型,体内外分化分别形成畸胎瘤和拟胚体.结论:采用囊胚和去透明带的桑葚胚建立孤雌胚胎干细胞系获得成功.该方法为人类纯合子的胚胎干细胞建系提供基础,在自体细胞治疗领域中具有潜在的应用价值.
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细胞松弛素B对U87细胞增殖及凋亡的影响
目的：研究细胞松弛素B（ CB）对人胶质瘤细胞系U87细胞增殖及凋亡的影响及机制。方法采用CCK-8试剂盒检测不同浓度的CB对胶质瘤细胞系U87细胞增殖的影响并得出一个适时间及半抑制浓度（ IC50）。观察适半抑制浓度处理的细胞其透射电镜下的细胞形态及微丝改变。流式细胞术Annexin-Ⅴ-FITC/PI双染检测U87细胞的凋亡情况。结果不同浓度的CB对U87细胞的抑制效应呈时间及剂量依赖性。 CB作用于U87细胞的适作用时间为72 h，其适半抑制浓度为2.694×10-5 mol/mL。可诱导（12.667±1.159）％的细胞凋亡。电镜显示细胞内微丝结构，微丝断裂，出现大量短棒状微丝结构。结论 CB可能是通过破坏胶质瘤细胞质内微丝结构抑制U87细胞增殖，促进胶质瘤细胞凋亡。
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应用限制性显示技术筛选K562细胞脱核前后差异表达基因
目的应用限制性显示(RD)PCR技术筛选细胞松弛素B(CytochalasinB,CB)诱导K562细胞脱核前后的差异基因,探讨CB诱导细胞脱核的分子机制.方法用CB(终浓度为10μg/ml)处理K562细胞24 h,分别提取对照组和处理组细胞总RNA,将两组等量的细胞总RNA纯化为mRNA,反转录为cDNA,利用RD-PCR技术和聚丙烯酰胺凝胶电泳分离、筛选CB处理前后差异表达的基因.对筛选出的差异表达基因进行克隆、测序,在GenBank检索进行序列同源性分析.结果筛选及克隆了7个差异表达基因,其中水通道蛋白1(AQP1)基因经反转录PCR验证在CB诱导脱核的K562细胞中表达上调.结论AQP1基因在CB诱导K562细胞脱核过程中特异性高表达,提示其可能与细胞脱核及增殖抑制密切相关.
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细胞松弛素B和解冻方法对玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响
[目的]探讨细胞松弛素B和解冻程序对玻璃微细管法(GMP)玻璃化冷冻小鼠卵母细胞的影响.[方法]以小鼠MII期卵母细胞为模型,研究冷冻前细胞松弛素B预处理、不同解冻程序对小鼠卵母细胞冷冻效果的影响;随后对经GMP玻璃化冷冻的卵母细胞直接进行培养以检测冷冻是否诱发孤雌发育.[结果]与对照组相比,细胞松弛素B预处理的卵母细胞存活率、受精率、卵裂率及囊胚率没有显著差异(89.3%vs91.3%,44.0%vs40.4%,30.0%vs 27.7%,4.0%vs 6.4%;P＞0.05);采用连续浓度梯度递减解冻法的受精率明显高于间断浓度梯度递减解冻法(57.4%vs40.4%;P＜0.05),且前者的卵裂率和囊胚发育率也相对较高(40.2%vs 27.7%,14.5%vs 6.4%;P＞0.05).冷冻复苏后卵母细胞的孤雌发育率稍高于未经冷冻的卵母细胞(17.1%vs 3.2%;P＞0.05).[结论]细胞松弛素B预处理对MII期小鼠卵母细胞的GMP玻璃化冷冻保存效果没有影响;采用连续浓度梯度递减解冻法能明显提高复苏后卵母细胞的体外发育能力.
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细胞松弛素B预处理对小鼠卵母细胞玻璃化冻融后发育潜能的影响
目的:观察细胞松弛素B (Cytochalasin B,CB)预处理对小鼠卵母细胞玻璃化冻融后发育潜能的影响.方法:用浓度为0(对照)、5、10、20、40 μg/ml的CB分别预处理小鼠成熟卵母细胞后玻璃化冷冻,解冻后进行体外受精,观察卵母细胞的复苏率、受精率、6～8 cell胚胎形成率.结果:CB 20、40μg/ml预处理组复苏率高于对照组,差异有统计学意义(P＜0.01),20μg/ml组与40μg/ml组组间比较差异无统计学意义(88.7％ vs 87.6％,P=0.767);各组受精率、6～8 cell胚胎形成率差异无统计学意义(P＞0.05).结论:浓度为20、40μg/ml的CB对小鼠成熟卵母细胞冻融复苏率有改善作用.
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HL-60细胞胞质体的制备
建立悬浮培养细胞胞质体制备及鉴定方法,为细胞重构奠定基础.采用密度梯度离心法和低速离心法纯化人白血病HL-60细胞,在单独细胞松弛素B(CB)和联合秋水酰碱介导下,分别于34℃和25℃,50％ Percoll等密度梯度离心对HL-60细胞进行脱核,然后分别用38％和40％ Percoll密度梯度离心纯化胞质体;采用Wright-Giemsa染色和4,6-联脒-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)/羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)荧光染料双染色观察胞质体形态学变化;采用流式细胞术(FCM)检测胞质体表型和线粒体膜电位(MMP)以评价其活性.结果显示,CB联合秋水酰碱介导HL-60细胞脱核率为91.98％±4.29％,明显高于单独CB组(74.95％±3.02％)(P＜0.01);34℃组的脱核率和直径≥5μm胞质体比例均明显高于25℃组(P＜0.01,P＜0.05);38 ％Percoll密度梯度离心纯化胞质体纯度高于40％ Percoll组;纯化的HL-60胞质体表型无明显变化,12 h内其活性达80％以上.结果表明,CB联合秋水酰碱介导下50％ Percoll密度梯度离心脱核、38％ Percoll密度梯度离心纯化、DAPI/CFSE双染鉴定、MMP检测是制备和鉴定悬浮培养细胞胞质体的适宜方案.
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成年大鼠心房肌牵张激活钾通道的牵张敏感性和门控机制
目的 探讨成年大鼠心房肌细胞牵张激活钾通道(stretch-activated K+-selective channels,SAKCs)的电生理学特性,确定皮质细胞骨架在通道门控机制中的作用,对从通道水平阐明机械-电反馈具有重要的理论和实际意义.方法 联合应用单通道膜片钳技术和压力钳技术,在急性分离的成年大鼠心房肌细胞是上,采用细胞贴附(cell-attached)方式记录SAKCs的活动.结果 实验所记录的通道为SAKCs,通道闪烁样开放,无整流特性.当细胞外液为高K+液(140 mmol/L)时,翻转电位为0 mV.钳制膜电位+60 mV时单通道的电导值为(59±5)pS,-60 mV时为(51±8)pS.通道约在负压刺激开始700～800 ms内被快速激活,刺激解除后,通道快速在500 ms内去激活.超过-30 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)的刺激可使多个通道同时开放.实验中未观察到通道活动达到饱和现象.单通道电流幅度不受负压刺激的影响.随膜片钳电极内负压的增加,通道开放概率增大,呈刺激强度依赖性.Cytochalasin B不改变SAKCs的电流幅度,但增加SAKCs的开放概率,增强SAKCs的背景活动和对机械刺激的敏感性.结论 我们推测牛理状态下细胞皮质肌动蛋白内衬于细胞膜,可能作为细胞膜的并联成分承受部分细胞应力,并使脂质膜的应力减少,从而使SAKCs不易被激活.
