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多球壳菌素诱导系膜细胞凋亡及对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响
目的 观察多球壳菌素(ISP-1)对体外培养的正常大鼠肾小球系膜细胞(GMC)的促凋亡作用,研究ISP-1对细胞周期调节蛋白基因表达谱和凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2表达的影响.方法 体外培养大鼠GMC,加入100 μmol/L ISP-1干预,分别于作用6、12、24、48 h后以流式细胞术检测GMC凋亡,Hoechst33258/PI染色观察凋亡细胞形态变化,琼脂糖DNA凝胶电泳法观察凋亡细胞核小体DNA的断裂现象,并通过SuperArray Real-TimePCR细胞周期基因芯片测定ISP-1对细胞周期调节蛋白基因表达谱的影响,Western blotting法观察Bax和Bcl-2蛋白的表达.结果 ISP-1可显著诱导GMC凋亡,并呈一定的时间依赖性,作用48 h后细胞凋亡显著,Hoechst33258/PI荧光染色法可见亮蓝色的凋亡小体,琼脂糖凝胶电泳可见凋亡梯度的出现;PCR细胞周期基因芯片检测结果发现ISP-1可显著上调GMC Rad51、Atm、Brcal、Caspase3、cyelinA2、cyclinC、chek1、cyclinB1、cyclinB2、cyclinD2、cyclinF、Cdc25a和P27等一些与DNA损伤、凋亡和细胞周期调节蛋白相关的基因的表达;Westernblotting发现ISP-1可显著上调GMC Bax蛋白表达,下调Bcl-2蛋白表达.结论 ISP-1可时间依赖性诱导体外培养的正常大鼠GMC凋亡,其机制与影响细胞周期调节蛋白及凋亡相关基因的表达有关.
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Sublytic C5b-9刺激上调KLF4促进肾小球系膜细胞生成IL-23的作用
目的:研究转录因子KLF4调控sublytic C5b-9刺激肾小球系膜细胞(glomerular mesangial cell,GMC)诱导促炎因子白介素-23(IL-23)生成的作用.方法:构建KLF4的短发夹状小干扰RNA(shKLF4)及过表达质粒(pIRES2-KLF4).将pIRES2-KLF4或shKLF4转染GMC后再行sublytic C5b-9刺激,用qPCR、Western blot和ELISA法检查沉默或过表达KLF4基因后对GMC产生IL-23的影响.此外,构建IL-23基因近端启动子全长质粒,行荧光素酶报告基因实验测定沉默或过表达KLF4基因后对IL-23启动子活性的影响.结果:①Sublytic C5b-9刺激GMC后能明显促进IL-23的生成,而沉默KLF4基因后,由sublytic C5b-9诱导GMC产生的IL-23明显减少,但过表达KLF4后IL-23的水平则显著增加.②Sublytic C5b-9刺激GMC能显著上调IL-23的启动子活性,而沉默KLF4基因后由sublytic C5b-9诱导的IL-23启动子活性明显降低,但过表达KLF4后又能显著升高IL-23的启动子活性.结论:Sublytic C5b-9刺激诱导IL-23的生成可通过其刺激上调转录因子KLF4的表达而实现.
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沉默大鼠KAT7基因对亚溶解型C5b-9刺激GMC诱导趋化因子MCP-1生成的影响
目的:研究沉默大鼠赖氨酸乙酰基转移酶7(lysine acetyltransferase 7,KAT7)基因对亚溶解型(sublytic)C5b-9复合物刺激大鼠肾小球系膜细胞(glomerular messangial cell,GMC)诱导单核趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein-l,MCP-1)生成的影响.方法:针对KAT7基因不同位点,用DNA重组技术设计4个小发夹RNA(short hairpin RNA,shRNA),分别克隆到真核表达载体pGCsi-U6/Neo/GFP/shRNA中.之后,用NeonTM电转仪将上述质粒转染至体外培养的GMC中,再给予sublytic C5b-9刺激.行Western blot实验检查筛选出针对KAT7基因且有佳沉默效率的shRNA.此外,用real-time PCR和ELISA法分别检测GMC行不同分组处理后MCP-1的mRNA和蛋白水平.结果:核酸测序表明,重组的shKAT7质粒构建成功.Western blot显示,shKAT7-2是具备佳沉默效率的shRNA.用shKAT7转染GMC后,由sublytic C5b-9刺激GMC诱导的MCP-1基因表达水平显著下降.结论:成功构建了大鼠KAT7 shRNA真核表达质粒,并初步证实KAT7基因的表达能够促进sublytic C5b-9刺激大鼠GMC诱导趋化因子MCP-1的合成与分泌.
