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采用不同载体的玻璃化冷冻对人卵巢组织冻存效果的比较研究
目的 比较采用不同载体的玻璃化冷冻方案对人卵巢组织的卵泡形态、冻融后体外培养时卵泡生长和激素分泌能力的影响,寻找临床上简便易行且保存效果上佳的人卵巢组织玻璃化冷冻方案.方法 将16例患者的卵巢组织切割成皮质小条后随机分配到新鲜组和不同载体玻璃化组,包括冷冻管组、小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面玻璃化组.观察各组卵巢组织卵泡形态;冻融后的卵巢组织行体外培养,比较卵泡生长情况以及培养液中雌二醇和孕酮的浓度.结果 冻融后各组原始卵泡正常形态率均低于新鲜组,差异有统计学意义(P < 0.05).冷冻管组、小微滴组、不锈钢网筛组和固相表面组,原始卵泡形态正常率分别为(64.57±11.84)%、(78.36±7.62)%、(77.21±6.51)%和(84.70±5.03)%.固相表面组原始卵泡形态正常率明显高于其他玻璃化组(P < 0.05).体外培养液中雌二醇和孕酮的平均水平随培养时间逐渐升高.固相表面玻璃化组两种激素平均浓度明显高于其他玻璃化组.培养后卵巢组织中原始卵泡所占比例均较新鲜组下降,生长卵泡比例升高.固相表面玻璃化组培养后生长卵泡比例明显高于其他玻璃化组.结论 固相表面玻璃化冷冻可以保存大部分原始卵泡的正常形态,并能较好地保存其体外生长和性激素分泌功能.该技术简便易行且冷冻效果好,适合人卵巢组织玻璃化冷冻的临床使用.
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不同冷冻方法对人卵巢组织血管内皮生长因子表达及血管生成的影响
背景:人卵巢组织冷冻已成为一种保存生育能力的手段,卵巢组织移植后必须经过血管重建过程才能恢复血供,冷冻保存和复苏技术是影响移植后卵巢组织血管重建的关键.目的:比较新型玻璃化冷冻和慢速冷冻后人卵巢组织血管内皮生长因子表达情况及微血管密度,探讨不同冷冻方法对人卵巢组织血管重建的影响.方法:8份卵巢组织标本取自子宫内膜癌患者手术切除的正常卵巢组织,将每份卵巢皮质切成1.5 mm×1.5 mm×1.0 mm大小的组织块共12块后,随机数字表法分为3组:对照组(新鲜组)、新型玻璃化冷冻组和慢速冷冻组.将新型玻璃化冷冻组卵巢组织块依次在含体积分数7.5%乙二醇+体积分数7.5%二甲基亚砜+体积分数20%胎牛血清的TCM-199培养液和含体积分数15%乙二醇+体积分数15%二甲基亚砜+0.5 mol/L蔗糖的TCM-199培养液中平衡脱水,然后直接浸入液氮并装入冷冻管保存,解冻时按浓度梯度1.0,0.5,0.25 mol/L蔗糖和含体积分数20%牛血清的TCM-199培养液依次洗脱冷冻保护剂.将慢速冷冻组人卵巢组织块放入盛有1 mL冷冻液(含1.5 mol/L二甲基亚砜+体积分数20%牛血清+0.1mol/L蔗糖的TCM-199培养液)的1.8 mL冷冻管内平衡,然后放入程序冷冻仪中按设定程序进行冷冻.解冻时按浓度梯度1.0 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖、0.5 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖、0.25 mol/L二甲基亚砜+0.1 mol/L蔗糖和0.1 mol/L蔗糖依次洗脱冷冻保护剂.冻融组及对照组均进行体外培养.免疫组织化学观察培养0,2,4,6 d各组人卵巢组织血管内皮生长因子和CD34表达情况,并进行微血管计数.结果与结论:3组人卵巢组织培养前后间质细胞中均见血管内皮生长因子成斑片状弱表达,培养2 d血管内皮生长因子表达均增加并达到峰值,培养4 d均开始减弱,6 d时进一步减弱;与慢速冷冻组相比,新型玻璃化冷冻组血管内皮生长因子表达更接近对照组.3组人卵巢组织培养2 d微血管密度均增加并达到峰值,对照组和新型玻璃化冷冻组明显高于慢速冷冻组(P<0.05):慢速冷冻组培养4 d时微血管密度较培养2 d时显著下降(P<0.05);3组培养6 d时微血管密度较培养2 d时显著下降(P<0.05).与慢速冷冻法相比,新型玻璃化冷冻法能更好地保存人卵巢组织间质细胞和细胞外基质,对卵巢组织血管内皮生长因子表达及微血管生成的影响更少.
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不同冷冻方案保存人类卵巢组织的活性比较
背景:卵巢组织冷冻保存被认为是保存女性生殖内分泌功能安全、有效的方法,但目前尚无统一确定的方案.目的:探讨3种冷冻方案对人类卵巢组织保存冷冻效果及卵泡活性的影响.方法:采用丙二醇慢速程序冷冻法、二甲基亚砜玻璃化冷冻法、液氮直投法对20例人类卵巢组织进行冷冻保存,复苏后采用细胞存活/死亡荧光分析法计数有活性的细胞,体外培养测定培养液雌二醇浓度及各级卵泡计数,判断3种不同冷冻方案对人类卵巢组织活性的影响.结果与结论:不同冷冻方案冻融后卵巢组织块的活性卵泡率均低于新鲜卵巢组(P＜0.05),二甲基亚砜组低,液氮直投法组与慢速程序冷冻法组差异无显著性意义.体外培养各冷冻组分泌的雌二醇水平比较,第4天时二甲基亚砜组低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组(P＜0.05),至第8天时各冷冻组雌二醇水平与新鲜卵巢组一致.培养14d组织学观察,各组卵巢组织内生长期卵泡比例增多,始基卵泡仍然占主要的.新鲜卵巢组织正常卵泡的总数高于冷冻组(P＜0.05),二甲基亚砜组的正常卵泡数低于液氮直投法组和慢速程序冷冻法组(P＜0.05).提示冷冻保存对卵巢组织卵泡有一定的损伤,但仍能保存大部分始基卵泡的活性,经体外培养后可进一步发育并具有分泌功能,在3种冷冻方案中,慢速程序冷冻法和液氮直投法的冷冻效果优于二甲基亚砜玻璃化冷冻法,液氮直投法操作简便,冷冻效果稳定.
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玻璃化冷冻及程序冷冻对人卵巢组织卵泡活性的影响
目的：比较玻璃化冷冻及程序冷冻对人卵巢组织卵泡活性的影响。方法：将15例人卵巢组织20 min内运至实验室，切割成1mm×5mm×5mm大小的卵巢皮质片，随机分为新鲜组、玻璃化冷冻组及程序冷冻组。玻璃化冷冻组及程序冷冻组均采用优化的实验方法进行。新鲜及复苏组织体外培养后，在光镜及电镜下分析卵泡的形态正常率，采用激素释放试验及异体移植试验检测冷冻复苏的人卵巢组织的功能，并与新鲜组比较。结果：冷冻复苏组及新鲜对照组卵巢组织皮质内均可见形态正常和异常的始基及初级卵泡，新鲜对照组卵泡形态正常率显著高于玻璃化冷冻组和程序冷冻组（P＜0．05）；程序冷冻组形态正常率稍高于玻璃化冷冻组（P＞0．05）。3组均可见超微结构正常及异常的原始卵泡、初级卵泡。卵巢皮质片体外培养后持续分泌雌二醇和孕酮。新鲜组激素分泌水平高于玻璃化冷冻组和程序冷冻组，但差异无统计学意义（P＞0．05）。异体移植试验显示，程序冷冻组较玻璃化冷冻组具有更高的移植物回收数及卵泡密度。结论：由于程序冷冻人卵巢组织卵泡具有较高的发育潜能，因此其较玻璃化冷冻更有应用前景。
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玻璃化冷冻对人类卵巢皮质组织形态学和凋亡的影响
[目的]检测玻璃化冷冻方法对人卵巢皮质组织形态学和凋亡情况的影响,为其进一步应用于肿瘤患者卵巢生育力保存的安全性及可行性奠定基础.[方法]卵巢组织来自4例因疾病原因行部分卵巢切除术的患者,术后病理均提示无肿瘤细胞转移或其他干扰实验结果的病灶存在.将获得的卵巢组织分离出皮质切割成薄片,采用自身对照,随机平均分为新鲜对照组(F组)和玻璃化冷冻组(Ⅴ组),两组薄片进行HE染色后,比较两组卵巢组织冻融前后的卵泡形态与各级卵泡所占比例及组织间质形态,原位末端转移酶标记(TUNEL)技术和Westernblot检测卵巢组织冻融前后细胞的凋亡情况.[结果]F组的原始卵泡、初级卵泡、次级卵泡分别为(55.5±4.9)％、(34.6±1.6)％和(9.9±7.6)％,Ⅴ组的各级卵泡比例分别为(51.2±5.1)％、(36.7±1.6)％和(12.1±3.5)％,两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05);使用TUNEL法比较两组的组织内细胞凋亡情况,其差异无统计学意义(P＞0.05);进一步使用Western Blot法检测两组组织内Cleaved Caspase-3的表达量,其结果与TUNEL法一致,两组间差异无统计学意义(P＞0.05).[结论]玻璃化冷冻法对卵巢组织的形态学和凋亡没有明显的影响,但其大规模临床应用仍有待更多的研究论证.
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银制封闭式冷冻载体改善人卵巢组织异种移植效果的研究
目的:探讨银制封闭式玻璃化冷冻载体促进人卵巢组织冷冻后移植严重免疫缺陷(SCID)鼠新生血管效果.方法:收集2015年4月至2016年6月在我院妇科手术治疗的患者卵巢组织共8例,每例患者标本随机等量分配到银制封闭式冷冻管及传统封闭式冷冻管玻璃化冷冻保存.选取40只SCID鼠,分为银制封闭式玻璃化冷冻管组及传统封闭式玻璃化冷冻管组(每组20只),分别移植两种封闭式玻璃化冷冻法复苏后的卵巢皮质到SCID鼠皮下,测定CD31反映卵巢皮质新生血管,比较两组人卵巢组织冷冻复苏后移植SCID鼠皮下保存效果.结果:移植后3天和7天,两组中卵巢皮质新生血管数差异无统计学意义(P＞0.05);移植后14天和21天,银制封闭式玻璃化冷冻管组中卵巢皮质新生血管数高于传统封闭式玻璃化冷冻管组(P＜0.05).结论:银制封闭式玻璃化冷冻管与传统封闭式玻璃化冷冻管相比能更好地保存卵巢皮质功能,在深低温保存人卵巢组织中具有应用价值.
关键词： 银制封闭式玻璃化冷冻管 玻璃化冷冻 人卵巢组织 移植 血管生成 -
新型玻璃化冷冻法在人卵巢组织深低温保存的应用
目的:分析新型玻璃化冷冻方法(NIV)与其他冷冻方法在人卵巢组织冷冻中的保存效果.方法:对10例患者的卵巢组织皮质片进行NIV法(NIV组)与程序化慢速冷冻法(慢速冷冻组)、滴入法玻璃化冷冻法(滴入法组)深低温保存,并与未行冷冻的新鲜卵巢组织(新鲜组)进行凋亡检测、组织体外培养和形态学分析、培养液中乳酸脱氢酶(LDH)浓度测定,并进行比较.结果:①新鲜组中正常始基卵泡百分率高于各冷冻组(P＜0.01).正常形态始基卵泡数目在各冷冻组间比较,差异无统计学意义(P＞0.05).②各组卵巢皮质中始基卵泡凋亡发生率:各冷冻组均较新鲜组明显增加(P＜0.01);各冷冻组间两两比较,差异均无统计学意义(P＞0.05).卵巢间质细胞凋亡发生率:各冷冻组较新鲜组明显增加(P＜0.01);在各冷冻组间比较,NIV组间质细胞凋亡率较慢速冷冻组和滴入法组明显降低(P＜0.05).③各冷冻组LDH浓度均高于新鲜组(P＜0.01).在各冷冻组间比较,NIV组LDH浓度低于慢速冷冻组和滴入法组(P＜0.01).结论:NIV法较程序化慢速冷冻和滴入法玻璃化冷冻法能更好地保存卵泡周围的间质细胞.
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两种浓度玻璃化冷冻液对人卵巢组织的冷冻保护效果比较
目的 比较两种不同浓度玻璃化冷冻保护剂对人卵巢组织的冷冻保存效果.方法 收集2013年8月-2014年5月9例行妇科手术的患者卵巢组织,使用直接覆盖法(DCV)玻璃化冷冻法保存.玻璃化冷冻保护液采用高浓度和低浓度两组.高浓度组冷冻保护液为15％ (V/V)二甲亚砜(DMSO) +15％ (V/V)乙二醇+0.5 mol/L蔗糖组成;低浓度组冷冻保护液为12％ DMSO+12％乙二醇+0.5 mol/L蔗糖组成,比较两组中始基卵泡形态正常率,始基卵泡及间质凋亡发生率.结果 高浓度组中正常形态始基卵泡百分率同低浓度组相比,差异无统计学意义(P＞0.05);低浓度组始基卵泡凋亡发生率为29.7％ (58/195),高浓度组始基卵泡凋亡发生率为42.1％(69/164),差异有统计学意义(P＜0.05).低浓度组中卵巢间质细胞凋亡阳性率为30.2％ (162/537),高浓度组中间质细胞凋亡阳性率为41.9％(206/492),差异有统计学意义(P＜0.05).结论 DCV玻璃化冷冻法中,低浓度冷冻保护液能通过减少细胞毒性,更好地保存始基卵泡及周围间质细胞,值得推广应用.
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人卵巢组织慢速冷冻保护液中添加抗凋亡剂研究
目的 探讨在人卵巢组织慢速冷冻保护液中添加抗凋亡剂对人卵巢组织的冷冻保存效果.方法 收集2012年3月-2013年4月行妇科手术的患者卵巢组织共9例,使用慢速冷冻法保存.实验组冷冻保护液中添加抗凋亡剂维生素C,并与未添加抗凋亡剂组(对照组)比较始基卵泡形态、始基卵泡及间质细胞凋亡发生率.结果 实验组中始基卵泡形态正常百分率高于对照组(P＜0.05);在凋亡发生率检测中,实验组与对照组相比较,始基卵泡和间质细胞凋亡发生率降低(P＜0.05).结论 慢速冷冻法中,冷冻保护液中添加抗凋亡剂能更好地保存始基卵泡及周围间质细胞,在深低温保存人卵巢组织中具有推广价值.
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抗凋亡剂在人卵巢组织新型玻璃化冷冻法中的应用研究
目的 探讨在新型玻璃化冷冻法中添加抗凋亡剂是否改善人卵巢组织冷冻保存效果.方法 收集2012年10月-2013年8月行妇科手术的患者卵巢标本共10例,使用新型玻璃化冷冻法保存.实验组冷冻保护液中添加抗凋亡剂维生素C,与未添加维生素C组(对照组)比较始基卵泡中卵母细胞和颗粒细胞超微结构、始基卵泡及间质凋亡发生率.结果 实验组中卵母细胞和颗粒细胞超微结构正常百分率高于对照组(P＜0.05).在凋亡发生率检测中,实验组和对照组始基卵泡凋亡发生率分别为21.6％ (49/227)、38.6％ (91/236),差异有统计学意义(P＜0.001).卵巢间质凋亡分析中,实验组和对照组凋亡发生率分别为(21.33±3.41)％、(33.46±3.09)％,差异有统计学意义(P＜0.001).结论 在新型玻璃化冷冻法中添加抗凋亡剂能更好地保存始基卵泡及周围间质细胞,改善玻璃化冷冻效果.
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新型玻璃化冷冻法对人卵巢组织超微结构保存的研究
目的 探讨新型玻璃化冷冻法对人卵巢组织超微结构的保存效果,尤其是对卵巢间质细胞的保存效果.方法 收集2007年6月-2009年1月在我院行妇科手术的患者卵巢组织共8例,使用新型玻璃化冷冻法和慢速冷冻法保存,比较两种冷冻方法对于始基卵泡卵母细胞、颗粒细胞、卵泡周同间质细胞超微结构保存效果.结果 对于始基卵泡卵母细胞和颗粒细胞,发现两种冷冻方法之间无显著差异(P＞0.05)；在间质细胞保存中,新型玻璃化冷冻法与慢速冷冻法相比较,正常间质细胞百分率增加(P＜0.05).结论 新型玻璃化冷冻法与慢速冷冻法相比能更好地保存卵泡周围间质细胞,在深低温保存人卵巢组织中具有较广阔的应用前景.
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液氮直投及程序冷冻冻存人卵巢组织的研究
目的 液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织效果的比较研究.方法 采用液氮直投法及程序冷冻法冻存人卵巢组织,解冻后苏木素-伊红染色检测冷冻前后各级卵泡(始基卵泡、初级卵泡和次级卵泡)的组织形态,然后将卵巢组织体外培养3天,检测培养上清雌激素水平.结果 液氮直投法、程序冷冻法始基卵泡形态正常率分别为72.96%、81.87%,差异有统计学意义(χ2=11.27,P<0.05);初级卵泡形态正常率分别为58.62%、34.48%,差异有统计学意义(χ2=6.79,P<0.05).第3天、第6天血清雌激素水平检测,液氮直投法与程序冷冻法比较差异无统计学意义(108.38±9.27 vs 105.15±9.13,151.08±16.64 vs 147.38±20.48,均P>0.05).结论 程序冷冻法以及液氮直投法可有效保存卵巢组织,对卵巢组织和功能的影响较小,而且液氮直投法操作更简便、快捷.
