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Wnt诱导分泌蛋白3对软骨细胞增殖分化的作用
目的 研究重组人Wnt诱导分泌蛋白3(rhWISP3)对人永生化软骨细胞株T/C-28a2增殖和分化的作用,探讨其作用是否通过胰岛素样生长因子-1(IGF-1)信号通路发生.方法 分别应用不同浓度rhWISP3干预T/C-28a2细胞株,用[3H]-脱氧胸腺嘧啶([3H]-TdR)摄入法测定细胞增殖活性.rhWISP3与重组人IGF-1蛋白(rh IGF-1)同时干预T/C-28a2细胞,[3H]-TdR摄入法测定细胞增殖活性.免疫印记法检测不同浓度rhWISP3干预的T/C-28a2细胞Ⅱ型胶原表达变化.用IGF-1信号通路阻断剂JB1干预细胞后,免疫印记法检测rhWISP3对T/C-28a2细胞Ⅱ型胶原表达的影响.结果 rhWISP3对软骨细胞增殖无明显影响.rh IGF-1明显促进T/C-28a2细胞增殖,rhWISP3对rh IGF-1促T/C-28a2细胞增殖作用无影响.rhWISP3明显促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达,呈浓度依赖性.rh IGF-1干预T/C-28a2细胞能明显促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达.IGF-1信号通路阻断剂JB1能阻断rh IGF-1促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达作用,不能阻断rhWISP3促进软骨细胞Ⅱ型胶原的表达作用.结论 rhWISP3对T/C-28a2细胞增殖作用无明显影响,呈浓度依赖型促进Ⅱ型胶原的表达,这种促表达的作用可能是通过独立于IGF-1信号通路而产生.
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沉默WISP3基因抑制子宫内膜癌细胞增殖及侵袭力
目的 探讨小分子干扰RNA(siRNA)沉默Wnt诱导分泌蛋白3(WISP3)基因对子宫内膜癌HEC-1A细胞增殖、凋亡和侵袭能力的影响.方法 培养子宫内膜癌HEC-1A细胞,将其随机分为siRNA-WISP3组、siRNA-对照序列组和空白对照组,应用实时荧光定量PCR技术检测3组细胞中WISP3基因表达,MTT法检测3组细胞转染后增殖能力,流式细胞术检测3组细胞凋亡情况,Transwell法检测3组细胞迁移和侵袭的能力.结果 siRNA-WISP3组细胞中WISP3 mRNA相对表达量显著低于siRNA-对照序列组和空白对照组,差异有显著性(F=95.134,P＜0.01).与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-WISP3组细胞24、48、72和96 h时细胞增殖能力显著降低,差异有统计学意义(F=23.684～93.472,P＜0.05).siRNA-WISP3组细胞凋亡率显著高于siRNA-对照序列组和空白对照组,差异有统计学意义(F=130.685,P＜0.01).与siRNA-对照序列组和空白对照组相比,siRNA-WISP3组迁移细胞数和侵袭细胞数均降低,差异均有统计学意义(F=13.914、16.632,P＜0.05).结论 特异性下调子宫内膜癌HEC-1A细胞中WISP3基因表达可抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力,加速细胞凋亡,有望成为子宫内膜癌基因治疗的潜在靶位.
关键词： 子宫内膜肿瘤 Wnt诱导分泌蛋白3 细胞增殖 肿瘤侵润 -
WISP3基因突变体的构建及在COS-7细胞中的表达
目的:通过构建晚发型脊柱骨骺发育不良伴进行性骨关节病(spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressive arthropathy,SEDT-PA)致病型(1000T/C,840 delT)Wnt诱导分泌蛋白3(wnt-inducible secreted protein 3,WISP3)的真核表达载体,并将其表达于真核表达系统COS-7细胞系,为研究WISP3突变致SEDT-PA的机制奠定基础.方法:从正常人软骨细胞获得野生型WISP3基因的全长cDNA(WT-WISP3):用定点突变方法构建携带WISP3基因致病型的重组真核表达质粒MUT1000T/C/pcDNA3.1(+)和MUT840delT/pcDNA3.1(+);以空白载体pcDNA3.1(+)为对照,脂质体转染法将重组质粒瞬时转染COS-7细胞,48 h后提取转染细胞的总RNA和总蛋白;半定量RT-PCR和免疫印迹方法检测WISP3基因的表达.结果:经测序证实,构建的野生型和突变型WISP3基因的全长cDNA序列分别与文献及前期报道的SEDT-PA患者WISP3基因突变类型一致;酶切鉴定证实,成功构建了3个重组真核表达质粒[WT-WISP3/pcDNA3.1(+),MUT1000T/C/pcDNA3.1(+)及MUT840delT/pcDNA3.1(+)];半定量RT-PCR和免疫印迹示,重组质粒在COS-7细胞中均高效表达.结论:成功构建了SEDT-PA致病基因WISP3的突变体并在COS-7细胞中得到表达,为进一步探讨SEDT-PA的发病机制创造了条件.
