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加减驻景方含药血清对AKT基因转染后ARPE-19细胞表达VEGF的影响
目的 探讨加减驻景方含药血清对AKT基因转染后人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)细胞表达VEGF的影响.方法 制备SD大鼠加减驻景方含药血清及空白血清,建立AKT基因转染ARPE-19细胞模型,体外培养,分为5个组,正常组为ARPE-19细胞常规培养,转染模型组(模型细胞,常规条件培养),含药血清组(模型细胞,给予含药血清干预培养)、空白血清组(模型细胞,给予空白血清干预培养)和阳性对照组(模型细胞,给予康柏西普干预培养).设立不同时间和不同浓度,通过CCK-8法检测各组血清及阳性组药物对细胞毒性、增殖的影响;通过ELISA检测各组细胞上清液中VEGF的表达.结果 蛋白质印迹法(Western blot)显示,转染模型组与正常组比较,AKT蛋白的表达量明显增加,差异有统计学意义(P＜0.05).CCK-8示,细胞培养24、48h后,AKT基因转染可促进ARPE-19细胞增殖(P＜0.05),培养72h后,对细胞增殖影响不大(P＞0.05).10、20μg/ml康柏西普及5％、10％的含药血清对模型细胞的增殖有抑制作用(P＜0.05),各浓度空白血清组对模型细胞组的增殖影响不大(P＞0.05).酶联免疫吸附试验(ELISA)检测显示:转染模型组细胞上清液中VEGF表达量高于正常组(P＜0.05),康柏西普组与含药血清组均显著低于模型组(P＜0.05),其中康柏西普组低于含药血清组,差异有统计学意义(P＜0.05).空白血清组与模型组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).结论 AKT基因转染后可诱导ARPE-19细胞的增殖,促进VEGF的表达.加减驻景方含药血清对AKT基因转染后ARPE-19细胞的增殖及VEGF的表达有抑制作用.加减驻景方可能通过抑制VEGF的过度表达发挥干预CNV生成的作用.
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H2O2诱导ARPE-19细胞损伤模型的建立及蓝莓花青素的保护作用
目的 建立H2O2诱导视网膜色素上皮细胞ARPE-19(acute retinal pigment epithelial-19)细胞损伤模型,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用.方法 采用MTT法测定细胞存活率,免疫荧光法测定细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平.以浓度0～3 200 μmol·L-1的H2O2为诱导剂,刺激细胞2、6、24 h,用1、5、10 mg·L-1花青素提取物(blueberry anthocyanin extract,BAE)预处理细胞6、24 h,比较对细胞的保护作用,确定H2O2的浓度及诱导时间.通过ARPE-19细胞损伤模型的建立,研究蓝莓花青素对细胞的保护作用.结果 以800 μmol·L-1 H2O2刺激2h为条件,建立ARPE-19细胞损伤模型,细胞存活率为63.69％.5 mg·L-1蓝莓花青素提取物、锦葵色素(malvidin,My)及其葡萄糖苷(malvidin-3-glucoside,Mv-3-glc)和半乳糖苷(malvidin-3-galactoside,Mv-3-gal)预处理6h后,细胞存活率明显提高(P＜0.01),分别达到86.57％、115.72％、98.15％、127.97％;细胞中ROS水平明显下降(P＜0.05),依次减少52.38％、95.38％、77.55％、116.09％.结论 蓝莓花青素可以有效抑制H2O2诱导产生的视网膜细胞氧化损伤,其中主成分锦葵色素及其糖苷发挥重要作用.
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槲皮素磷脂复合物激活Nrf2信号通道增强对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用
目的 研究槲皮素磷脂复合物对叔丁基氢过氧化物(tert-butyl hydroperoxide,tBHP)诱导ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用及相关机制.方法 采用溶剂法制备槲皮素磷脂复合物,并测定磷脂复合物在水和氯仿中的溶解度.实验细胞分组:溶媒对照组、模型对照组、槲皮素及其磷脂复合物组(含400μmol·L-1、200 μmol·L-1和100 μmol·L-1三个浓度).MTr法检测细胞活力,AnnexinV-FITC/PI法检测细胞凋亡,酶标仪检测细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性及丙二醛、总抗氧化能力水平,荧光素DCFH-DA探针法测定细胞内活性氧含量,Real time PCR、Western Blot检测细胞核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)、血红素加氧酶一1、醌氧化还原酶一l和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达水平.结果 形成磷脂复合物后槲皮素在水和氯仿中的溶解度分别为(38.36±2.91) μg·mE-1、(1351.27±28.12)I μg·mL-1,较单体显著提高;浓度为400 μmol·L-1、200 μmol·L-1和100 μmol·L-1的槲皮素及其磷脂复合物对氧化损伤ARPE-19细胞有保护作用,而且高、中浓度的槲皮素磷脂复合物的作用优于单体;浓度为200 μmol·L-1的槲皮素及其磷脂复合物均能降低氧化损伤ARPE-19细胞的凋亡率,槲皮素磷脂复合物作用明显优于单体;槲皮素磷脂复合物能显著提高细胞内超氧化物歧化酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性,降低细胞内活性氧、丙二醛水平,槲皮素单体则不能,但槲皮素及其磷脂复合物能提高细胞内总抗氧化能力;槲皮素及其磷脂复合物能诱导Nrf2核转位,激活Nrf2通道,上调血红素加氧酶-1、醌氧化还原酶-1和谷氨酸半胱氨酸连接酶的表达.结论 槲皮素形成磷脂复合物后,水溶性、脂溶性提高,对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用比单体强,其作用机制与激活Nrf2信号通路,上调下游Ⅱ相代谢酶和抗氧化酶的表达有关.
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Bax、 Bcl-2在丙烯醛诱导的ARPE-19细胞凋亡中的作用
目的 观察Bax、Bcl-2蛋白在丙烯醛诱导的体外培养ARPE-19细胞凋亡中的作用.方法 将培养的ARPE-19细胞置于含有体积分数10％胎牛血清的完全培养基中,于37℃、体积分数5％ CO2培养箱孵育;用不同浓度(50 μmol·L-1、100 μmol·L-1)丙烯醛处理对数期培养的ARPE-19细胞24 h,设不加药的空白对照组,用流式细胞仪检测丙烯醛诱导ARPE-19细胞的凋亡情况,Western blot检测ARPE-19细胞中Bax、Bcl-2蛋白的表达情况.结果 流式细胞仪显示,早期在空白对照组中细胞凋亡率为2.97％,50 μmol·L-1丙烯醛处理组中为4.67％,100 μmol·L-1丙烯醛处理组中为50.07％;晚期凋亡细胞在空白对照组中细胞凋亡率为1.66％,50 μmol·L-1丙烯醛处理组中为24.24％,100 μmol·L-1丙烯醛处理组中为6.77％.Western blot显示空白对照组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0.293 9,50 μmol·L-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1.389 2,100μmol·L-1丙烯醛处理组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1.496 1.结论 丙烯醛可以通过激活凋亡蛋白Bax及抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达来导致ARPE-19细胞凋亡.
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硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛损伤ARPE-19细胞的保护作用
目的 利用丙烯醛建立年龄相关性黄斑变性(age-related macular degeneration,AMD)的细胞损伤模型,并观察硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导ARPE-19细胞损伤的保护作用.方法 MTT比色法检测ARPE-19细胞的生长周期.将25μmol·L-1、50 μmol·L-1、100 μmol·L-1丙烯醛加入对数生长期的ARPE-19细胞中处理24 h,复制AMD细胞水平的损伤模型并确定其损伤浓度；预先加入50 μmol·L-1、100 μmol·L-1、150 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体及150 μmol·L-1硫辛酸预处理对数生长期细胞24 h后,再加入已经确定细胞损伤模型的丙烯醛浓度处理24 h,前后两次处理后均用MTT比色法检测细胞活性,HE染色法检测细胞数量和形态改变.结果 ARPE-19细胞24 h内开始贴壁,4～5d细胞生长开始融合,第1-6天后生长分裂迅速进入对数生长期,6d后即开始随着时间延长活性显著下降.当丙烯醛浓度达到50 μmol·L-1时,ARPE-19细胞数量明显减少,细胞肿胀、坏死,胞浆收缩、细胞核聚集；而当硫辛酸烟酸二联体浓度达到100 μmol·L-1时即可以明显减少50 μmol·L-1丙烯醛诱导的ARPE-19细胞活性的降低,防止凋亡小体的形成.MTT结果显示:100 μmol·L-1硫辛酸烟酸二联体+丙烯醛处理组(50 μmol·L-1)抗凋亡效果优于100 μmol·L-1硫辛酸组,但差异无统计学意义(P＞0.05).结论 利用丙烯醛可以诱导ARPE-19细胞损伤来建立AMD细胞损伤的模型,硫辛酸烟酸二联体对丙烯醛诱导的ARPE-19细胞损伤具有保护作用.
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金雀异黄素对缺氧诱导的ARPE-19细胞中VEGF表达的影响
目的研究长期缺氧对体外培养的人ARPE-19细胞血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein ,Gen)对其表达的影响和机理.方法使用半定量RT-PCR和酶联免疫吸附试验(ELISA)检测ARPE-19细胞中VEGF mRNA和蛋白的表达,分析不同浓度Gen以及PD98059、Tyrphostin A25对ARPE-19细胞缺氧24 h诱导的VEGF表达的影响.结果 (1)正常对照组有少量VEGF表达,缺氧24 h可明显提高ARPE-19细胞VEGF mRNA和蛋白的表达,分别为(9.566±1.528)倍和(2.636±0.499)倍;(2)Gen(50 μmol·L-1,100 μmol·L-1,200 μmol·L-1)与缺氧组对比,分别抑制缺氧组VEGF mRNA表达的55.03%、78.72%、90.69%,蛋白的表达量为(189.60±20.20) ng·L-1、(117.70±21.97) ng·L-1、(49.70±13.17) ng·L-1,抑制作用呈浓度依赖性;(3)PD98059、Tyrphostin A25也可抑制缺氧诱导的VEGF mRNA表达的67.24%和56.25%,蛋白表达量为(86.33±12.47) ng·L-1、(98.08±2.42) ng·L-1.结论 Gen可抑制长期缺氧诱导的ARPE-19细胞VEGF表达,并可能是通过抑制p42/p44MAPK途径和HIF-1途径共同抑制VEGF的表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有预防和潜在的治疗价值.
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硫辛酸烟酸二联体拮抗丙烯醛诱导ARPE-19细胞凋亡的作用机制
目的：探讨Bax、Bcl-2蛋白在硫辛酸烟酸二联体拮抗丙烯醛诱导的体外培养 ARPE-19细胞凋亡中可能的调控作用。方法：ARPE-19细胞置于含有10％体积分数胎牛血清的DMEM培养基，37℃、体积分数5％CO2培养箱中培养，待培养瓶底部ARPE-19细胞长至70％时，种6孔板，用不含血清的DMEM培养基培养24 h ，细胞换液。实验分为3组：空白对照组、丙烯醛组和硫辛酸烟酸二联体组。细胞流式检测各组ARPE-19细胞凋亡情况，Western blot检测Bax、Bcl-2蛋白的表达水平。结果：细胞流式显示正常细胞在空白对照组中为94．8％，丙烯醛组中为60．98％，硫辛酸烟酸二联体组中为91．34％。Western Blot显示空白对照组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0．2939，丙烯醛组的 Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为1．3892，硫辛酸烟酸二联体组的Bax/Bcl-2蛋白表达的比值为0．5558。结论：硫辛酸烟酸二联体对ARPE-19细胞的保护作用机制是通过激活抗凋亡蛋白Bcl-2来抑制凋亡蛋白Bax的表达。
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CCK-8法检测蓝光和白光对ARPE-19细胞增殖的影响
目的:探讨蓝光和白光分别光照不同时间对人视网膜色素上皮(ARPE-19)细胞增殖的影响,为进一步检测光照损伤过程中相关因子的变化情况,研究光照损伤过程中的信号转导机制奠定基础.方法:收集生长状态良好的ARPE-19细胞进行实验,制作CCK-8标准曲线,确定实验合适的ARPE-19细胞密度及CCK-8试剂的反应时间.将细胞分为避光组、蓝光组、白光组,分别光照3、6、9h,再避光培养12h后采用CCK-8法检测不同光源光照不同时间对ARPE-19细胞增殖率的影响.结果:通过CCK-8标准曲线选择每孔细胞数量为20000个,CCK-8溶液作用4h后测量相应吸光度值.CCK-8检测结果示,避光组、蓝光组、白光组三组细胞光照不同时间细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.01).蓝光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.001),且随着光照时间的延长,细胞增殖率逐渐降低.白光组细胞光照3、6、9h,各时间点细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),其中光照3h和6h细胞增殖率比较,差异有统计学意义(P<0.05),而光照9h分别与光照3、6h细胞增殖率比较,差异均无统计学意义(P=0.253、0.120).白光光照3～6 h细胞增殖率呈下降趋势,而光照6～9h细胞增殖率呈现上升趋势.相同光照时间,蓝光组和白光组细胞增殖率均低于避光组,且蓝光组细胞增殖率均低于白光组,差异均有统计学意义(P<0.05).结论:光照能抑制ARPE-19细胞的增殖,其中蓝光光照细胞增殖率明显低于白光,且随光照时间的增长,细胞增殖率进一步降低.
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补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用
目的:探讨补肾养血明目方含药肠吸收液对氢醌(hydroquinone,HQ) 诱导的人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19) 氧化应激损伤的保护作用.方法:采用不同浓度HQ诱导体外培养ARPE-19 细胞氧化损伤,确定佳造模浓度;制备补肾养血明目方含药肠吸收液.采用CCK-8法检测补肾养血明目方含药肠吸收液对ARPE-19细胞活力的影响,TUNEL技术观察其对细胞凋亡的保护作用,以及化学比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase,GSH-Px)的活性.结果:当HQ浓度达到90滋mol/L以上时,ARPE-19 细胞活性明显降低.相较于模型组,预防给药时,浓度1%和2%补肾养血明目方含药肠吸收液对HQ损伤具有有显著保护作用(均P<0.01),0.5%和5%含药肠吸收液对HQ损伤有一定保护作用(均 P<0.05);治疗给药时,1%和2%含药肠吸收液对 HQ 损伤有一定保护作用(均 P<0郾05).与模型组相比,预防组的细胞凋亡率显著下降(P<0.01),治疗组的细胞凋亡率有一定下降(P<0.05).抗氧化酶检测结果显示与模型组相比,预防组和治疗组均能明显提高SOD和GSH-Px含量(均P<0.05),其中预防组的作用更为显著(P<0.01,P<0.05).结论:补肾养血明目方对HQ诱导的ARPE-19 细胞氧化损伤有保护作用,其作用机制可能与增加细胞内抗氧化酶的含量有关.
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金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响
目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响.方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响.结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰.Gen(50,100,2μmol/L组)与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性.结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值.
关键词： 金雀异黄素 ARPE-19细胞 低氧 碱性成纤维细胞生长因子 -
金雀异黄素对缺氧诱导的人ARPE-19细胞内碱性成纤维细胞生长因子蛋白表达的影响
目的:研究低氧对体外培养的人ARPE-19细胞碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)表达的诱导作用,以及金雀异黄素(genistein,Gen)对其表达的影响.方法:采用免疫荧光组织化学技术和激光共聚焦显微镜,以荧光比值来表示bFGF的表达,半定量分析低氧处理不同时间对体外培养的ARPE-19细胞bFGF蛋白表达的诱导作用,以及Gen对低氧诱导的bFGF表达的影响.结果:对照组有低水平bFGF蛋白的表达,随着低氧处理时间的延长,荧光比值在1h达到高峰.Gen(50,100,200 μ mol/L组)与二甲基亚砜(DMSO)对照组相比,均可明显抑制低氧诱导的bFGF的表达,且这种抑制作用呈浓度依赖性.结论:Gen可抑制低氧诱导的ARPE-19细胞bFGF表达,提示Gen对视网膜新生血管的形成具有潜在的预防及治疗价值.
关键词： 金雀异黄素 ARPE-19细胞 低氧 碱性成纤维细胞生长因子
