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定向诱导的骨髓间充质干细胞局部移植对缺血骨骼肌的影响
目的探讨经血管内皮生长因子(VEGF)诱导扩增的骨髓间充质干细胞(MSC)自体局部移植对缺血骨骼肌的影响.方法新西兰白兔随机分为两组:10 μg/L VEGF诱导扩增的骨髓间充质干细胞自体局部肌肉注射,以单侧股动脉及分支动脉结扎并离断1 h后的股内侧部作为扩增细胞局部移植组(n=8),以注射磷酸盐缓冲液组为对照组(n=8).缺血28 d分别检测缺血骨骼肌部位的毛细血管密度和细胞凋亡.结果缺血28 d时,骨髓细胞局部移植组毛细血管密度明显高于对照组(P＜0.001),毛细血管与肌纤维比例亦高于对照组(P＜0.05);该组细胞凋亡率明显低于对照组(P＜0.001).结论特定条件下体外扩增的骨髓间充质干细胞活体内局部移植对肢体缺血具有治疗作用.
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脂肪MSCs分泌的DKK-1抑制慢性粒细胞白血病细胞K562的增殖
目的 研究间充质于细胞(MSCs)抑制慢性粒细胞白血病细胞K562增殖的分子机制,为临床治疗提供理论依据.方法 利用脂肪来源的MSCs与慢性粒细胞白血病细胞K562共培养,通过中和抗体实验、3H-TdR掺入法、细胞周期流式分析、RNA干扰和定量PCR等技术,分析K562细胞增殖能力、WNT信号通路的基因表达变化.结果 与MSCs共培养后,K562的增殖减少了77%(P<0.05),处于G0/G1期的细胞比例为62.1%±5.8%,明显高于K562单独培养时的45.2%±6.9%(P<0.05).当用Transwell隔开MSCs和K562细胞后,上述抑制作用仍然存在.利用中和抗体实验发现MSCs抑制K562增殖是通过分泌DKK-1.将MSCs表达的DKK-1用RNA干扰敲低后,再与K562共培养,可重新增加K562细胞WNT信号通路中β-CATENIN、C-MYC和CYCLIN D2的表达,减弱了对K562增殖的抑制作用.结论 脂肪来源的MSCs可以通过分泌可溶性分子DKK-1抑制白血病细胞K562的WNT信号通路,将其细胞周期阻滞在G0/G1期,从而抑制其增殖.
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人脐血间充质干细胞体外诱导分化为神经元样细胞
目的 从人脐血中分离单个核细胞(MNCs)、体外培养扩增间充质干细胞(MSCs)并研究其生物学特性和定向诱导能力. 方法 无菌条件下采集脐血,肝素抗凝,分离单个核细胞.用DMEM/F12培养基进行纯化和扩增培养,分别向神经元样细胞诱导,获取MSCs,显微镜下观察它的形态、尼氏体染色;取扩增2、5、7代的MSCs,免疫细胞化学法检测nestin表达和神经元样细胞特异性标记. 结果 诱导扩增后的MSCs尼氏体染色阳性,第2、5、7代MSCs的nestin的阳性表达率分别为(51.2±3.2)%、(34.6±2.7)%、(11.3±3.3)%;神经元特异性烯醇化酶(NSE)在原代细胞无表达,而在2、5、7代MSC的阳性表达率分别为(11.4±2.3)%、(21.78±3.1)%、(40.7±3.4)%. 结论 人脐血MSCs具有神经干/祖细胞的特性,在一定条件下能向神经元样细胞分化.
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骨髓间充质干细胞移植减轻衰老大鼠肠损伤
目的 探讨骨髓问充质干细胞(MSCs)在D-半乳糖制备的衰老大鼠小肠损伤巾的作用.方法 SD大鼠30只,随机均分为3组:对照组、衰老模型绀和MSCs防治组.给衰老模型组大鼠每日皮下注射D-半乳糖400 mg/kg,连续4个月.MSCs防治组在衰老模型制备成功后,给予尾静脉输注3×106个MSCs.分别采用硫代巴比妥酸和黄嘌呤氧化法检测小肠组织中丙二醛(MDA)含和超氧化物歧化酶(SOD)活性;观察3组大鼠小肠组织结构的差异,并用表达绿色荧光蛋白(GFP)的腺病毒载体标记MSCs,以确定MSCs的植人情况.结果 GFP标记的MSCs移植给大鼠后,能向小肠组织迁移并存活.MSCs防治组SOD活性为133.7±3.6 U/mL,显著高于衰老模型组的105.1±4.3 U/mL(P<0.01);而MDA含量为5.9±0.1 nmoL/mL,显著低于衰老模型组的6.9±0.1 nmol/mL(P<0.01).模型组大鼠肠道黏膜损伤严重,而MSCs防治组大鼠的小肠损伤有明显修复.结论 骨髓间充质干细胞能够一定程度上减轻D-半乳糖致衰老大鼠的小肠损伤.
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微环境对体外间充质干细胞向心肌样细胞分化的作用
目的 研究心肌组织中何种细胞对骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞定向分化起决定性作用.方法 分离培养骨髓MSCs、心肌细胞(CM)和内皮细胞(EC).MSCs经BrdU标记后与CM、EC分别共培养和单独培养,通过形态学、免疫细胞化学和双重免疫细胞化学鉴定.结果 分离培养的MSCs、CM和EC纯度高于95%.标记MSCs与CM共培养后,细胞具有心肌细胞样形态.4周时,有44%的细胞BrdU与肌动蛋白(sarcomeric actin)或连接蛋白43(connexin-43)双重免疫细胞化学染色阳性.与EC共培养以及单独培养时,MSCs形态变化不明显,无双染阳性细胞出现.结论 CM对骨髓MSCs向心肌样细胞的定向分化具有重要作用.
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bFGF2抑制BMP9诱导小鼠间充质干细胞C3H10T1/2向成骨细胞分化
目的 观察碱性成纤维细胞生长因子(FGF2)对于骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的间充质干细胞C3H10T1/2成骨分化的影响,并探讨其机制.方法 用BMP9和FGF2重组腺病毒感染C3H10T1/2细胞,测定成骨早期标志物碱性磷酸酶(ALP)活性变化,茜素红S染色观察成骨晚期标志物钙盐沉积,pl2SBE-luc荧光素酶报告基因活性检测,Western blot检测经典信号通路smadl/5/8和成骨关键转录因子RUNX2的变化,以及晚期成骨标志物骨钙素(OCN)的表达.结果 FGF2抑制了BMP9诱导的早期成骨指标ALP和晚期成骨指标钙盐沉积和骨钙素的表达,抑制了经典的BMPs-Smad信号通路,抑制了成骨关键的转录因子Runx2的表达.结论 FGF2可抑制BMP9诱导的间充质干细胞C3H10T1/2的成骨分化.
关键词： 碱性成纤维细胞生长因子 骨形态发生蛋白9 间充质干细胞 成骨分化 -
骨髓间充质干细胞经不同时间成骨细胞诱导后细胞性质比较
目的探讨骨髓间充质干细胞经成骨细胞诱导不同时间后的细胞性质.方法成人骨髓分离单个核细胞(MNC),体外培养获得间充质干细胞(MSC),传至第4代后加入地塞米松(DEX)、抗坏血酸和β-甘油磷酸,诱导成骨分化.诱导7 d和14 d后的细胞与正常成人成骨细胞分别加入不同浓度骨形态发生蛋白-2(BMP-2)和DEX,48 h后检测细胞增殖、碱性磷酸酶(ALP)活性和骨钙素(OCN)的含量.结果 BMP-2和DEX对诱导7 d后的细胞有明显的刺激增殖和ALP活性的作用;对诱导14 d后的细胞,BMP-2和DEX都不能刺激细胞增殖和ALP活性,但OCN含量明显增加.正常成人成骨细胞对BMP-2和DEX作用的反应与诱导14 d的成骨样细胞基本一致,但其OCN绝对含量明显高于MSC来源的成骨细胞.结论骨髓MSC向成骨诱导7 d和14 d后细胞分化程度不同.诱导时间在MSC的成骨分化中是一个非常关键的因素,但其机制和佳诱导时间尚需进一步研究.诱导14 d后的MSC的成骨活性低于正常成人成骨细胞.
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成人骨髓间充质干细胞定向诱导为血管内皮样细胞
目的通过体外分离和纯化成人骨髓间充质干细胞,体外定向诱导分化为血管内皮样细胞,探讨为组织工程血管的构建提供种子细胞的可能性.方法收集骨髓血,提取单个核细胞进行体外培养扩增,用含10 μg/L VEGF培养液诱导细胞,利用免疫组织化学、流式细胞仪技术、电镜技术、放射免疫技术鉴定和观察细胞特性.结果分析了5个标本,每个标本体外扩增10代可获细胞数为8×1010个左右;诱导14 d后细胞VWF强阳性表达,接近汇合的细胞外观呈现特征性的鹅卵石样形态,透射电镜显示胞质内可见大量吞饮小泡,细胞接种在细胞外基质凝胶(ECMgel)中可形成毛细血管样结构,细胞上清液中6-酮-前列素F1α含量为(29.939±19.935)μg/(109·L).结论实验结果提示利用本实验方法,可以获得足够量较为单一、具有较强增殖能力的间充质干细胞, 间充质干细胞可以在体外定向分化为具有内皮血管细胞特性的细胞.
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人脐带间充质干细胞抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化
目的 探讨人脐带间充质干细胞(UCMSCs)的生物学特性及其对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响.方法 从人脐带中分离、培养得到间充质干细胞,通过免疫细胞化学染色等方法对其进行表型鉴定；同时采用MTT法检测UCMSCs对同种异体脐血淋巴细胞转化的影响,以验证 UCMSCs在免疫调控方面的作用.结果 成功培养出UCMSCs,培养至第3代的UBMSCs形态为均一梭形,细胞倍增时间为51.6h.细胞表面表达MSCs相关抗原CD29,但不表达造血细胞相关抗原CD34,细胞化学染色显示PAS(+)、NBE(+)、POX(-),表明此种自脐带中分离得到并诱导扩增的成纤维样细胞为间充质干细胞；CCMSCs对PHA刺激的脐血淋巴细胞,增殖反应具有免疫抑制作用,且该作用与UCMSCs接种数量有关,、当接种量为2 000个/孔时,抑制率高达60.8％.结论 UCMSCs具有免疫抑制作用,能抑制同种异体脐血淋巴细胞的转化,且此种抑制作用与接种的脐血淋巴细胞数量有关.
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Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中的作用
目的 研究Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3H10T1/2向心肌细胞特异分化过程的作用以及机制.方法 构建过表达Islet-1细胞模型;流式细胞计量术检测转染效率;CCK-8检测细胞增殖;Western blot检测Islet-1、cTnT和p-Akt/TA-kt蛋白表达;RT-qPCR检测心肌早期特异转录因子GA TA4、N xk2.5和Mef2c mRNA表达.结果 随着MK2-206(Akt抑制剂)浓度的增加,细胞增殖抑制率升高(P<0.05),对Akt活性的佳抑制浓度为8nmol L/;随着Islet-1诱导分化时间的延长,感染细胞的p-Akt/T-Akt蛋白表达降低(P<0.05),心肌特异转录因子GATA4、Nkx2.5和Mef2c基因的表达升高(P<0.05);而经MK-2206处理的感染细胞,GAT A4、Nk 2x.5和M fe2 c的复制在第1周时出现明显升高后又逐渐降低(P<0.05).结论 Akt在Islet-1诱导间充质干细胞C3 H10T1/2向心肌细胞特异分化过程中于不同分化阶段发挥着不同的调节作用.
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miR-210参与调控间充质干细胞向肿瘤相关成纤维细胞转化
目的 探讨miR-210是否在乳腺癌细胞诱导人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSCs)向肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)转化中发挥作用.方法 Transwell 小室将乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231分别与hAD-MSCs共培养, RT-qPCR检测不同时间点(0、3、6及9 d)收取乳腺癌细胞中miR-210的表达;RT-qPCR检测共培养后hAD-MSCs向CAFs转化及CAFs相关特征标志物平滑肌肌动蛋白-α(α-SMA)和腱生蛋白-c(tenascin-c)的基因表达,用West-ern blot检测α-SMA和成纤维细胞活化蛋白-α(FAPA)的蛋白表达;慢病毒分别向乳腺癌细胞传导miR-210抑制剂和miR-NC,然后与同比例的MSCs混合注射到裸鼠皮下,动态观察肿瘤的生长情况,4周后分离提取肿瘤组织中的CAFs,RT-qPCR和Western blot检测CAFs中α-SMA、FAPA 和波形蛋白(vimentin)的表达.结果 与hAD-MSCs共培养后,乳腺癌细胞MCF-7和MDA-MB-231细胞中miR-210表达都持续上调(P<0.05).共培养条件下抑制肿瘤细胞表达miR-210可以抑制MSCs向CAFs转化(P<0.05).抑制肿瘤细胞miR-210的表达可以降低肿瘤生长(P<0.05).结论 miR-210作为一种重要的信息分子介导了肿瘤微环境中MSCs向CAFs转化.
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慢性再生障碍性贫血患者间充质干细胞对T细胞的抑制作用
目的 比较来源于正常志愿者和慢性再生障碍性贫血(CAA)患者骨髓间充质干细胞(MSCs)免疫抑制作用的区别.方法 培养5例正常志愿者和10例CAA患者的骨髓MSCs,比较两组MSCs的形态、细胞表型、细胞因子的表达,通过PHA刺激的T细胞增殖试验、混合淋巴细胞培养和T细胞周期检测比较两组MSCs对T细胞的抑制作用.结果 两组MSCs形态、表型基本相同.CAA来源的MSCs对PHA和同种异体抗原诱导的T细胞的抑制作用均低于正常志愿者来源的MSCs,加入正常志愿者的MSCs后有更多的T细胞阻滞在G0/G1期,但CAA来源的MSCs作用较弱.两组MSCs表达的肝细胞生长因子(HGF)和转化生长因子(TGF-β2)无明显区别,但CAA患者的MSCs表达的TGF-β1、3较正常志愿者MSCs表达的明显减少.结论 虽然CAA的MSCs在形态、增殖和细胞表型上基本正常,但其对T细胞的抑制作用减弱,在经过免疫抑制剂治疗后仍然存在,其异常是否与CAA的发病机制有关需要进一步研究.
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IFN-γ诱导的自噬抑制人胎盘胎儿侧来源间充质干细胞增殖
目的 探讨IFN-γ诱导无血清培养人胎盘胎儿侧来源MSCs自噬的发生,并分析自噬对细胞增殖的影响.方法 用酶消化法和无血清培养体系分离培养人胎盘胎儿侧来源MSCs,利用流式细胞仪和分化培养体系鉴定细胞属性;用质量浓度50 μg/L的IFN-γ处理入胎盘胎儿侧来源MSCs,以未处理细胞作为对照组,3-Ma处理为自噬抑制组;分别提取总蛋白,Western blot检测自噬标志基因LC3 Ⅰ/Ⅱ的表达;mRFP-GFP-LC3腺病毒感染细胞,观察细胞内点状聚集的情况;MTT法检测IFN-γ对细胞增殖的影响.结果 所分离细胞呈CD73、CD90和CD105阳性细胞,不表达CD14、CD34和CD45,具有向脂肪和成骨细胞分化的能力;IFN-γ可提高LC3Ⅱ的表达量(P＜0.05),荧光共聚焦显微境观察到IFN-γ处理细胞中的点状聚集显著增加;3-Ma可解除IFN-γ对MSCs增殖能力的抑制(P＜0.05).结论 IFN-γ诱导的自噬负调控人胎盘胎儿侧来源MSCs的增殖能力.
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与泌尿生殖窦间质细胞共培养诱导hUC-MSCs定向分化为前列腺上皮样细胞
目的 研究人的脐带间充质干细胞(hUC-MSCs)与特异性的组织细胞在体外共培养,观察hUC-MSCs是否能够被诱导定向分化.方法 原代培养hUC-MSCs和SD大鼠的泌尿生殖窦的间质细胞(rUGSSs).将细胞消化传代、扩增、鉴定.将两种细胞混合在鼠尾胶中进行三维体外共培养,加雄激素诱导两周后将含有细胞的鼠尾胶做冰冻切片免疫荧光分析前列腺细胞特异性的标志物.结果 将hUC-MSCs联合rUGSSs在体外诱导培养两周后,一些细胞表达前列腺上皮的标志物.包括基底细胞的标志物细胞角蛋白5(CK5)和P63蛋白、腔细胞的标志物细胞角蛋白8(CK8)染色阳性.结论 UC-MSCs与rUGSSs在体外共培养后,可以诱导为前列腺上皮样细胞.
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microRNA-21可调控Flk1+间充质干细胞的迁移
目的 用microRNA-21抑制刺转染Flk1+间充质干细胞(MSC),探讨microRNA-21对Flk1+MSC(MSC)迁移的影响.方法 在脂质体介导下用microRNA-21抑制剂瞬时转染Flk1+MSC,用Transweil技术检测细胞迁移,用Real-time PCR技术检测micro-RNA的表达.结果 与对照组相比,实验组中microRNA-21表达明显下调,实验组细胞在12、16和20 h迁移率分别是对照组的77.5%、71.3%和69.8%.结论 microRNA-21可调控Flk1+MSC的迁移.
关键词： MicroRNA-21 间充质干细胞 迁移 -
人脂肪来源间充质干细胞诱导人乳腺癌MCF-7细胞上皮间质转化
目的 探讨人脂肪来源间充质干细胞(hAD-MSCs)在乳腺肿瘤微环境中对乳腺癌细胞的影响.方法 采用Transwell体系间接共培养人乳腺癌细胞系(MCF-7)和hAD-MSCs,对共培养后的肿瘤细胞进行细胞形态,EMT相关标志以及肿瘤特性的检测.结果 与对照组相比,共培养之后的MCF-7细胞发生上皮间质转化.与hAD-MSCs共培养能明显促进乳腺癌细胞的侵袭和迁移,但对细胞周期和增殖能力没有明确的影响.结论 人脂肪来源间充质干细胞可诱导乳腺癌细胞上皮间质转化.
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OCT4异构体在人胚胎干细胞和间充质干细胞中的表达
目的 比较OCT4异构体(OCT4A、OCT4 B、OCT4 B1)及其调控因子在人胚胎干细胞(hESC)和人间充质干细胞(hMSC)中的表达.方法 利用RT-PCR、免疫荧光染色、流式细胞分析及体内/外分化实验,鉴定hESC及hMSC的生物学特性;应用real-time PCR、Western blot和流式细胞分析比较OCT4异构体及其转录因子NANOG,SOX2和mRNA结合蛋白LIN28在hESC及hMSC中的表达水平.结果 OCT4异构体mRNA在hESC和hMSC中均有表达,在hESC中的表达显著高于在hMSC中,并以OCT4A的差别为显著(P＜0.01);在蛋白水平,hESC表达OCT4A和OCT4B-256aa,hMSC不表达OCT4异构体蛋白.hESC高表达OCT4的调控因子NANOG、SOX2和LIN28;hMSC低表达SOX2,不表达NANOG和LIN28.结论 NANOG、SOX2和LIN28调控OCT4的表达,OCT4异构体在hESC和hMSC中的表达差异提示其可能是不同发育阶段于细胞自我更新和分化潜能等方面差别的主要因素之一.
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脐血来源间充质干细胞可抑制异体T细胞的反应
目的 研究脐血间充质干细胞(HUCB-MSCs)对异体T细胞的抑制作用.方法 体外培养HUCB-MSCs,流式细胞术测表面标记;取正常人外周血,免疫磁珠分离CＤ３+T细胞,将分离的CD3+T与HUCB-MSCs 1:1混合培养5d,PHA刺激或不刺激,采用3H-TdR掺入法观察T细胞增殖,ELISA方法检测细胞因子,流式细胞术观察细胞凋亡.结果HUCB-MSCs呈纺锤样的细胞形态,不表达CD14、CD34、CD45、HLA-DR,而表达CD29、CD44、HLA-ABC.HUCB-MSCs抑制PHA引起的T细胞增殖(5 230±550 vs10 500±800 counts/min,P＜0.001);HUCB-MSCs还能抑制异体T细胞分泌IFN-γ(510±60 vs1 580±100 pg/mL,P＜0.001)和TNF-α(590±20 vs1 180±30 pg/mL,P＜0.001),上调IL-4(16.3±8.2 vs4.1±1.8 pg/mL,P＜0.001)和IL-10(105±5 vs17 ±2 pg/mL,P＜0.001)分泌;HUCB-MSCs不诱导T细胞的凋亡.结论 HUCB-MSCs能抑制异体T细胞免疫反应.
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碱性成纤维细胞生长因子诱导人间充质干细胞向心肌样细胞分化
目的 研究碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)在体外诱导人骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化中的作用,及其对MSCs增殖的影响.方法 用含5-氮杂胞苷(5-aza)的培养基(A组)、含bFGF的培养基(B组)、含5-aza+bFGF的培养基(C组)以及普通培养基(对照组)培养人骨髓MSCs.观察细胞形态的改变;免疫细胞化学法检测α-actin、cTnT和connexin-43的表达;RT-PCR法检测Nkx2.5 、GATA- 4 和cTnT的mRNA水平;MTT法检测MSCs的增殖.结果 A组和C组的部分细胞呈肌细胞样改变,表达蛋白α-actin,cTnT和connexin43;A组和C组的cTnT、Nkx2.5 和GATA- 4的mRNA水平明显高于对照组,B组的Nkx2.5 和GATA- 4 的mRNA水平明显高于对照组;B组细胞增殖明显高于对照组,A组和C组细胞增殖明显低于对照组,但C组明显高于A组.结论 bFGF能明显促进MSCs增殖,与5-aza合用能更好地诱导人MSCs向心肌样细胞分化.
关键词： 间充质干细胞 碱性成纤维细胞生长因子 分化 心肌样细胞 -
骨髓间充质细胞来源的血管内皮样细胞与脐静脉血管内皮细胞抗凝基因表达的比较
目的 观察不同来源的血管内皮细胞抗凝能力的差异.方法 采用密度梯度离心及贴壁培养法对骨髓间充质干细胞(BMMSCs)进行体外培养、纯化和扩增,用含有VEGF(10μg/L)的诱导培养液对其进行体外诱导分化,1周后免疫组化染色鉴定Ⅷ因子相关抗原(VWF),用RT-PCR法检测BMMSCs来源的血管内皮样细胞及脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)的主要抗凝血基因的表达.结果 BMMSCs能够在体外成功诱导分化为血管内皮样细胞,但不表达主要抗凝基因的mRNA,而HUVEC能够表达这些基因的mRNA.结论 虽然BMSCs能够成功诱导分化为血管内皮样细胞,但它的抗凝能力较HUVEC弱.
