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P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体的构建及其体外表达
背景:NOD2/CARD15基因序列单核苷酸多态性(SNP)与欧美人群的克罗恩病(CD)明显相关,其中R702W、G908R和3020insC 3个SNP位点与CD的相关性尤为显著.而日本、韩国以及我国香港和浙江地区的研究均未发现上述3个SNP的改变,但近研究发现了可能与中国人CD相关的P268S突变.目的:构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体和体外转染体系,为研究突变型NOD2/CARD15的功能提供实验基础.方法:应用定点诱变技术构建P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,以阳离子脂质体介导体外转染技术瞬时转染人胚肾细胞HEK293T,以蛋白质印迹法和逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测HEK293T细胞NOD2/CARD15的表达.结果:经克隆、酶切、测序证实获得P268S突变型NOD2/CARD15基因,突变载体转入HEK293T细胞后,NOD2/CARD15有效表达.结论:成功构建了P268S突变型NOD2/CARD15真核表达载体,阳离子脂质体是人胚肾细胞有效的体外转染体系.
关键词： 基因 NOD2/CARD15 诱变 定点 转染 -
重组人源化ING4基因的构建及其对肺癌NCI-H460细胞生长抑制作用
目的:构建重组人源化hING4基因并探究其对肺癌细胞的生长抑制效应.方法:以pcDNA3.0-mING4重组质粒为模板.通过定点突变技术构建带有绿色荧光蛋白(GFP)的重组腺病毒Ad-hING4基因.用荧光显微镜和RT-PCR法检测hING4在肺癌细胞中的表达;Westem印迹法检测hING4对肺癌细胞中Bax、Bcl-2表达的影响;集落形成试验和FCM法检测hING4对肺癌细胞增殖和凋亡影响.结果:基因测序和PCR结果提示成功构建人源化Ad-hING4基因;并能在肺癌细胞中表达,对肺癌细胞有细胞毒作用;Westem印迹法检测结果提示基因在上调Bax表达同时下调Bel-2的表达;集落形成试验、FCM检测结果提示hING4基因可抑制肺癌细胞增殖并诱导凋亡.结论:成功构建了Ad-hING4基因,并能在体外抑制肺癌细胞生长.
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γ-聚谷氨酸生产菌株的常压室温等离子体诱变选育
γ-聚谷氨酸产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) HD 11经常压室温等离子体诱变处理,以不产生脂肽作为筛选标准之一,获得1株高产菌株HNCL1266,其γ-聚谷氨酸摇瓶发酵产量为26 g/L,较菌株HD11提高了30％,且遗传稳定.在5L发酵罐上,添加0.2 g/L的泡敌可有效抑制泡沫的产生,γ-聚谷氨酸产量达到30 g/L.
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透明质酸产生菌的诱变选育
分别以微波、超声波及微波.超声波复合诱变选育透明质酸产生菌,结果获得1株高产突变株,其透明质酸的产量较出发菌株提高了60%.经5次传代后,该菌株遗传性状稳定.
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甾体微生物羟化的耐温菌选育及转化条件研究
采用60Co射线对黑根霉SW3.41孢子进行诱变,筛选得到能在34℃生长并转化生产11α-羟基-16α,17α-环氧孕酮的菌株SW3.41-11-51.同时研究其转化工艺.结果表明,在加入终浓度12g/L的底物和3%的吐温-80条件下,以耐温黑根霉SW3.41-11-51转化43h的转化率达到43%,得到4.5g/L产物.
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N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶生产菌的选育
以产N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶的恶臭假单胞菌MZ0315为出发菌株,应用紫外和硫酸二乙酯的复合诱变,经底物类似物5-氟尿嘧啶的筛选,获得高产、稳定的优良菌株MF0506.经过发酵培养基优化,诱变株的产酶活力由出发菌株的0.443u/ml提高至0.680u/ml.
关键词： N-氨甲酰基-D-氨基酸酰胺水解酶 诱变 抗性筛选 -
基于pMTR1质粒的转基因小鼠突变研究模型的建立
目的:建立在基因组中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系,为体内基因突变研究提供有效的动物模型.方法:利用分子克隆技术构建pMTR1质粒.将其线性化后,用显微注射法注射入572只C57BL/6小鼠受精卵,再将它们分别移入45只受体母鼠的输卵管中,共产仔44只,存活35只,采用PCR,PCR-Southern和基因组Southern杂交三级筛选法鉴定子代小鼠.以4只经基因组Southern杂交证实在基因组DNA中整合有多拷贝结构完整的pMTR1质粒的小鼠作Founder小鼠,进行转基因小鼠的建系工作.对每个Founder小鼠已有的F1代及F2代转基因小鼠的基因组DNA进行pMTR1质粒回收实验.结果:从转基因小鼠基因组中可以回收出结构、功能完整的pMTR1质粒. 结论:(1)建立了在基因组DNA中整合有pMTR1质粒的C57BL/6转基因小鼠家系;(2)该转基因小鼠能用作哺乳动物体内突变研究模型.
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可溶性Ⅰ型补体受体活性区基因的突变修正
目的:修正可溶性Ⅰ型补体受体(sCR1)PCR过程中造成的碱基突变,保证基因序列氨基酸编码的准确性,为蛋白表达和基因转染打下基础. 方法:采用掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法,对sCR1活性区基因中错配的碱基加以修正,用点杂交方法筛选突变子阳性克隆,测序鉴定.结果: 40℃洗膜,放射自显影示除阴性对照和1个样品外,阳性对照和其余19个克隆均显阳性黑斑;56℃洗膜,放射自显影示5个样品为阳性.阳性克隆测序结果正确.结论:掺尿苷寡聚核苷酸介导的定点突变法是一种快速而可靠的DNA突变修正方法,但仍存在较高的假阳性,点杂交有助于阳性克隆的筛选.
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乙烷基亚硝基脲诱变获得一例小眼畸形小鼠及其遗传实验
目的 通过乙烷基亚硝基脲(ENU)诱导小鼠突变手段获得眼部异常小鼠模型.方法 选用8～ 10周龄C57BL/6J (B6)雄鼠40只,腹腔内注射ENU.将处理雄鼠与同品系母鼠交配,在其后代小鼠中筛选眼部异常个体,并对突变个体进行遗传实验.结果 通过ENU诱变手段获得一例可稳定遗传的小眼畸形小鼠,该小鼠小眼畸形表型受小鼠遗传背景影响,在B6背景中外显率为90％,BDF1背景中外显率为0,BDBN2背景为27.8％.结论 ENU诱变获得了类似人类小眼畸形疾病的小鼠模型,为人类相应眼病研究提供一种新模型.
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PH对ICR-170诱变日本血吸虫雌虫生殖腺的影响
目的探讨溶液pH对诱变剂ICR-170诱变日本血吸虫雌虫生殖腺的影响程度.方法用5种pH值(pH 7.2-8.0)的ICR-170溶液处理日本血吸虫尾蚴30 min或45 min后,经皮肤接种小鼠观察雌虫诱变率和成虫回收率.结果溶液pH值对ICR-170的诱变作用影响较大,诱变率随着溶液pH值的上升而下降.10μg/ml 45 min组和15μg/ml 30 min组在pH 7.2时的雌虫诱变率分别为pH 7.8时的13倍和6倍,当pH＞7.4时,2种浓度的ICR-170引起的诱变率基本接近.溶液pH值对于成虫回收率的影响程度远低于对诱变率的影响程度.结论在诱变日本血吸虫雌虫生殖腺时,ICR-170具有较强的pH依赖型特性.
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远端与近端结肠癌在临床、病理和分子生物学特征上的区别
背景远端和近端结肠癌在起源，基因暴露，环境诱变及肠道菌群等方面均存在差异。然而这些差异很少被用来解释如何影响肿瘤的发生机制，特异的治疗响应及预后情况。研究系统性探索了远端与近端结肠癌的差异及这些差异的临床意义。
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诱变选育高产辅酶Q10的类球红细菌
以类球红细菌(Rhodobacter sphaeroate)EIM-3为出发菌株,首先分析该菌株对不同拮抗因子的小致死浓度:叠氮钠:10 mg/L;对羟基苯甲酸:360 mg/L;维生素K3:20 mg/L;罗红霉素:40 mg/L.通过紫外线和NTG诱变结合不同拮抗因子筛选获得辅酶Q1o产量达(170.12±0.57) mg/L的突变菌株EIM-UN4,该菌株连续传代5次,遗传稳定性好.15 L发酵罐放大验证,表明突变株的耗糖速率减缓,辅酶Q10产量和产率分别为185.71 mg/L和15.91 mg/g DCW,比原始菌株分别提高了29.31％和21.17％.
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产紫杉醇葡萄座腔菌J11菌株诱变获得高产菌株
通过诱变处理从野生型的产紫杉醇内生真菌葡萄座腔菌菌株J11获得高产紫杉醇诱变菌株.野生型菌株J11孢子经甲基磺酸乙酯诱变处理后,经过制霉菌素筛选获得抗性突变菌株,并经过高效液相色谱分析突变菌株的紫杉醇含量.结果表明,在10个制霉菌素抗性突变体中,7个突变菌株的紫杉醇含量低于野生型菌株,但有2个突变菌株的紫杉醇含量高于野生型菌株,其中,J11-8突变菌株的紫杉醇含量在未经优化条件下摇瓶发酵培养,其紫杉醇产量达到1 024.2 μg,/L.野生型J11菌株的紫杉醇产量为615.1 μg/L.诱变菌株J11-8的紫杉醇产量比野生型出发菌株J11提高了66.5％.产紫杉醇高产菌株J11-8具有大规模工业化发酵生产紫杉醇的能力.
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高产谷胱甘肽酵母菌的诱变选育以及发酵条件的初步研究
谷胱甘肽是生物体内重要的活性3肽.对野生酵母菌进行紫外结合激光诱变筛选,得到一株Sac-charomyces cerevisiae2-2-2谷胱甘肽高产酵母菌.同时对加入前体氨基酸发酵条件进行了优化,使得谷胱甘肽产量提高了68.7%.
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洛法他汀产生菌的激光诱变育种研究
使用氦氖激光、Nd∶YAG倍频脉冲激光和铜蒸气激光,以不同剂量对洛法他汀产生菌L-1-109进行诱变照射,同时对激光修复作用进行探讨.结果表明,被照菌株产洛法能力有不同程度提高.氦氖激光照射高提高23.2%,Nd∶YAG倍频脉冲激光照射高提高20.8%.铜蒸气激光照射提高6.3%.将菌株紫外线辐射后再以低剂量氦氖激光照射,获得一株高产优质新菌种L-2-101,产洛法能力提高30%以上,遗传性能稳定.
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产腺苷蛋氨酸酵母菌株的选育
目的 筛选产腺苷蛋氨酸(SAM)的酵母菌并进行诱变育种.方法 以选择性培养基筛选酵母菌株并用高效液相色谱检测SAM.利用紫外线和γ-射线处理对菌株进行诱变.结果 从34份土样中筛选到1株产SAM的酵母菌Q95菌株,经过5轮紫外线诱变和1轮γ-射线诱变,筛选到1株SAM产量显著提高的正突变株Q6-13.摇瓶发酵27 h后,其SAM产量达到1 860 μg/mL,与Q95相比提高了86.9%.在15 L外循环气升式生物反应器中补料发酵22 h后,Q6-13的SAM产量达到2 540 μg/mL.结论 通过筛选和诱变,得到了1株高产SAM的酵母菌突变株,为SAM的微生物发酵法规模化生产奠定了基础.
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拉曼被孢霉γ-亚麻酸高产突变株的选育
目的诱变、筛选γ-亚麻酸(GLA)高产菌株。方法采用5-氟尿嘧啶、紫外线、氯化锂复合诱变及自然分离的方法，对拉曼被孢霉AS 3.3413进行诱变筛选。结果获得一株GLA高产突变株F5。该菌株GLA产量较原始菌株提高了300%。传代实验证明该菌株遗传性质稳定。经对其发酵培养基及发酵条件的优化，该菌株GLA生产能力可达1 153.63 mg/L，较原始菌株提高335.87%。结论拉曼被孢霉GLA高产突变株F5已达工业生产菌株要求。
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柱晶白霉素产生菌的原生质体制备、再生和诱变
目的:对柱晶白霉素产生菌SK-06的原生质体制备和再生的条件,以及再生菌的产生抗生素能力进行了研究.方法:考察甘氨酸浓度对菌丝生长的影响,摸索和确定溶菌酶酶解的佳条件,考察再生培养基的组成.结果:溶菌酶酶解的佳条件为:2 mg/ml、30℃、90 min.再生率达到15%.通过二次再生后,获得了一株高产菌株,效价提高了238%.经过紫外线诱变的孢子和原生质体的效价提高了95%和160%.结论:原生质体制备和再生选育高产菌株是一种有效的菌种选育手段.
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金褐霉素高产菌株的推理选育
为了得到金褐霉素高产菌株,采用紫外和化学诱变方法,再通过对突变株推理选育得到一株制霉菌素抗性的菌株NTG-UV-35的产素单位高,达到2 330.43μg/mL,比出发菌株R22-103提高了87.25%;该菌株传代的稳定性试验表明:NTG-UV-35有较稳定的产抗生素遗传特性.
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硫酸二乙酯与紫外线复合诱变选育糖化酶高产菌株的研究
目的 通过诱变育种,提高糖化酶生产菌株黑曲霉WT(Aspergillus niger WT)的产酶能力.方法 用硫酸二乙酯(DES)和紫外线(UV)进行复合诱变,通过淀粉透明圈法筛选优势菌株,并通过摇瓶发酵对优势菌株的产酶能力进行验证.结果 通过DES诱变,得到一株产酶能力为11 737 U/ml的突变株DES3,较原始菌株黑曲霉WT产酶能力提高30 %;将DES3进行紫外诱变,得到一株产酶能力为13 858 U/ml的突变株DUV1,产酶能力较DES3提高18 %,较原始菌株黑曲霉WT提高53 %.结论 本论文采用DES和UV复合诱变的方法,有效提高了糖化酶生产菌株黑曲霉WT的产酶能力,对糖化酶产业的发展具有重要意义.
