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凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax在慢性鼻及鼻窦炎伴嗅觉障碍患者嗅黏膜中的表达
目的 研究Bcl-2和Bax在慢性鼻及鼻窦炎(CRS)伴嗅觉障碍患者嗅黏膜中的表达,探讨其对嗅觉神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)凋亡的调节作用.方法 采用康涅狄格化学感受临床研究中心所采用的嗅觉检查法——CCCRC (Connecticut Chemosensory Clinical Research Center)对46例行功能性鼻内镜手术的患者进行嗅觉评分并分组:A组,CRS伴嗅觉障碍25例；B组,CRS不伴嗅觉障碍10例；C组,单纯鼻中隔偏曲行鼻中隔矫正术11例.免疫组织化学方法检测Bcl-2、Bax在3组患者嗅黏膜中的表达.结果 在ORNs中,A组Bcl-2和Bax表达显著高于B组(q=3.24、4.29,P均＜0.05)和C组(q=8.56、12.99,P均＜0.01),A组Bcl-2/Bax比值显著低于B组(q=3.76,P＜0.05)和C组(q=6.67,P＜0.01);在基底细胞中,Bcl-2在3组表达无显著差异(q=0.68、0.69、1.06,P均＞0.05),Bax在A组的表达显著高于B组和C组(q=9.54、11.98,P均＜0.01),A组Bcl-2/Bax比值显著低于B组和C组(q=5.48、9.14,P均＜0.01);在A、B、C3组ORNs和基底细胞中,Bcl-2/Bax比值与嗅觉评分均呈正相关(rA分别为0.5631、0.8926,rs分别为0.5700、0.7991、rc分别为0.5694、0.8121,P均＜0.01).结论 细胞凋亡参与了CRS伴嗅觉障碍患者ORNs的减少,Bcl-2和Bax在此过程中起了重要的调控作用,Bcl-2/Bax比值决定细胞是否凋亡.
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嗅神经切断术后白血病抑制因子在嗅上皮中的表达
目的分析白血病抑制因子(Ieukemia inhibitory factor,LIF)与嗅感觉神经元(olfactory receptor neu rons,ORNs)再生的关系.方法建立嗅神经切断的小鼠动物模型,在术后8小时、2天、3天和5天分别通过免疫组化和相对半定量RT-PCR的方法,在蛋白和mRNA水平观察LIF及其特异性受体LIF-R在嗅上皮中的表达情况.结果 LIF和LIF-R的表达都是在术后8小时迅速、一过性地上升,随后又迅速恢复至对照组水平.LIF由残留的ORNs表达,LIF-R则由基底细胞和嗅鞘细胞(olfactory ensheathing cells,OECs)表达.结论 LIF是在ORNs凋亡再生机制中较早表达的一种细胞因子,凋亡中的ORNs产生并分泌的LIF作用于基底细胞和嗅鞘细胞,从而启动调节ORNs再生的一系列分子机制.
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外伤性嗅觉障碍大鼠嗅黏膜的组织学变化
目的 构建大鼠外伤性嗅觉障碍模型,观察不同时间点嗅黏膜组织学变化.方法 神经切断组(40只)和对照组(20只)大鼠均在显微镜下暴露左侧嗅球,沿筛板切断神经组切断大鼠左侧嗅神经.采用嗅觉诱发电位(olfactory evoked potentials,OEPs)和神经示踪验证造模效果.术后1天、5天、2周、3周、6周处理大鼠,处理前1天每组各取2只大鼠经鼻腔滴注辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP).嗅黏膜及嗅球冰冻切片后观察嗅上皮的厚度、细胞数量的变化以及嗅神经的连续性,并且行免疫组化观察嗅上皮中的新生嗅感觉神经元(olfactory receptor neurons,ORNs).结果OEPs及神经示踪证实手术方法可以完全切断嗅神经.术后1天,切断侧黏膜中ORNs出现凋亡,两组大鼠双侧嗅上皮厚度和细胞数量比值无明显变化.5天时切断侧嗅上皮中细胞数量减少,上皮厚度变薄,嗅球中无HRP标记纤维.术后2、3周大鼠嗅球中出现蓝色标记,嗅上皮厚度和细胞数量逐渐增加,但仍然与对照组有差异,此时嗅上皮中出现大量的新生ORNs.经过6周的恢复,嗅上皮厚度及细胞数量基本恢复至对照组水平,嗅上皮中有较多的新生ORNs,其轴突与嗅球重新建立神经联系,但是上皮中仍然有一定数量的凋亡细胞.结论 嗅神经切断术可以作为制作外伤性嗅觉障碍的可靠方法;由于ORNs具有再生能力,大鼠嗅神经切断后嗅黏膜在一定时间内基本恢复至正常水平.
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地塞米松对嗅感觉神经元环核苷酸门控通道mRNA表达的影响
目的 应用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR),观察地塞米松对大鼠嗅感觉神经元(olfactory receptor neurons,ORNs)环核苷酸门控通道(cyclic nucleotide-gated channels,CNG通道)A2亚基mRNA表达的影响.方法 将40只Wistar大鼠随机分为4组(每组10只):24小时激素组、2周激素组及各自对照组.激素组大鼠腹腔注射地塞米松:24小时激素组按1 mg/kg体重给药1次,2周激素组按0.2 mg/天给药.各对照组均给予生理盐水腹腔注射.通过实时荧光定量RT-PCR方法,检测各组ORNs的CNG通道CNGA2亚基mRNA的表达量.结果 24小时激素组和对照组CNG通道CNGA2亚基mRNA表达差异无显著性意义(P＞0.05);2周激素组CNGA2亚基mRNA表达显著高于对照组(P＜0.01).结论 地塞米松长期应用可以使ORNs的CNG通道CNGA2亚基mRNA表达上调,CNG通道的转录增强可能是糖皮质激素治疗嗅觉障碍的机制之一.
关键词： 糖皮质激素类 嗅觉受体神经元 环核苷酸调节蛋白激酶类 离子通道 -
嗅感觉神经细胞的分离与培养
目的建立哺乳动物嗅感觉神经细胞体外培养的方法.方法取成年家兔的嗅区粘膜,用胰酶和胶原酶消化法进行嗅感觉神经细胞的分离与原代培养,并应用抗神经微丝蛋白(NFP)抗体、抗嗅觉标记蛋白(0MP)抗体进行免疫细胞化学染色,同时采用甲苯胺蓝神经特异性染色和扫描电镜对其进行鉴定.结果从嗅粘膜分离以及原代培养得到的嗅感觉神经元,光镜、电镜下为典型的双极神经元,OMP、NFP阳性,神经元特异性染色阳性.分离的嗅感觉神经元可在体外存活数小时,其细胞形态、生存数量和存活时间均能满足体外实验的基本要求.结论本实验在家兔建立了较稳定、可靠的嗅感觉神经细胞分离和原代培养方法.为深入开展嗅感觉神经细胞的离体研究,提供了较为理想的材料来源和技术保障.
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嗅神经离断后大鼠嗅黏膜气味受体的表达变化
明显减少,差异具有统计学意义(t=63.960,P=0.000).随着术后恢复时间的延长,嗅神经离断侧再生嗅黏膜表达Olr1493基因受体的细胞逐渐增多,至第6周时基本和对照侧一致,分别为(417.8±32.4)个和(445.3±10.0)个,差异无统计学意义(t=2.600,P=0.060).结论 大鼠嗅神经离断后再生嗅感觉神经元及其受体数量可以恢复至正常水平,表达位置亦未发生变化.
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大鼠急性鼻-鼻窦炎致嗅觉障碍模型嗅黏膜微结构的变化
目的 观察大鼠急性鼻-鼻窦炎致嗅觉障碍模型中嗅黏膜微结构的变化情况,为进一步探索鼻-鼻窦炎对嗅觉功能影响的可能机制提供实验基础.方法 健康SD大鼠100只采用随机数字表法分为实验组(80只)和对照组(20只).实验组使用肺炎链球菌建立大鼠急性鼻-鼻窦炎动物模型,运用嗅觉功能行为学(食物小球埋藏法)检测实验模型的嗅觉功能,采用SPSS 13.0统计软件对该数据进行DunnettT3检验.分别于接种细菌后第1(A组)、2(B组)、3(C组)、4周(D组)各处死20只实验组大鼠;对照组(E组)大鼠未接种细菌且均于第1周处死.取包含鼻顶部嗅黏膜的鼻腔鼻窦黏膜组织,制作冰冻切片、采用免疫荧光技术观察嗅黏膜中成熟嗅感觉神经元和嗅鞘细胞的形态变化.结果 嗅觉功能行为学检测实验结果显示,A、B、C、D组大鼠找到食物小球的时间[分别为(402.9±9.3)、(453.7±7.3)、(351.9±8.9)、(278.7±8.1)s]均较对照组[(178.3±6.6)s]长,差异有统计学意义(P值均＜0.01).实验组嗅黏膜较对照组均有不同程度的成熟嗅感觉神经元数量减少及黏膜上皮层变薄倾向,尤以造模后第2周为严重,至第4周时轻.实验组大鼠嗅黏膜固有层嗅鞘细胞在出现短时间的减少后,自第2周起先于嗅感觉神经元出现数量增加.至第4周,固有层的嗅鞘细胞基本恢复正常.所有实验组动物嗅上皮均有少量嗅鞘细胞生长.结论 发生急性鼻-鼻窦炎时,嗅黏膜中成熟嗅感觉神经元和嗅鞘细胞均出现数量减少.但嗅鞘细胞先于嗅感觉神经元增多,并且嗅上皮亦出现少量嗅鞘细胞生长.
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嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元的影响
目的分析嗅神经切断对小鼠嗅感觉神经元(olfactory receptor neurons, ORN)凋亡情况的影响,并探讨这一造模方法的可靠性.方法取2月龄C57小鼠33只,随机分组后,实验组小鼠行嗅神经切断术,通过辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)顺行神经示踪验证造模成功与否.以脱氧核苷酸转移酶介导的生物素dUTP缺口末端标记技术(TdT mediated deoxyuridine triphosphate-biotin nick end labelling, TUNEL)观察术后8 h、2 d、3 d和5 d嗅上皮中ORN的凋亡情况,同时在蛋白和mRNA水平观察成熟ORN的特异性标记蛋白--嗅标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)在嗅上皮中的表达情况.结果嗅神经切断术后嗅球中无HRP标记.TUNEL和OMP 阳性反应发生于ORN,嗅神经切断术后TUNEL阳性细胞数显著增多,并于术后第2天达到高峰,与此同时OMP mRNA的表达水平开始显著下降,并在术后第5天降至更低,嗅上皮的厚度也相应变薄.结论本实验所采取的造模方法可以较可靠地切断小鼠的嗅神经,并造成小鼠嗅上皮中ORN的同步凋亡.
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嗅球摘除后嗅觉神经元凋亡的实验研究
目的研究凋亡是否参与嗅上皮正常生理更替和嗅球摘除后嗅觉神经元死亡而后再生的过程,探讨凋亡与神经元再生的关系.方法应用原位末端标记法和透射电镜观察正常成年大鼠以及摘除嗅球后大鼠嗅上皮16、32、48 h和3、7、30 d时凋亡的出现和改变情况.结果正常成年大鼠嗅上皮中有末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记(TUNEL)的阳性细胞(1.93±0.31)个/200 μm.摘除嗅球后TUNEL阳性细胞数增加,32 h达峰值(90.9±18.03)个/200 μm,以后迅速下降,维持于低水平.透射电镜下见嗅球摘除术后嗅觉神经元出现胞质浓缩、胞核染色质边聚等细胞凋亡的特征性超微结构改变.尚可见少量胞质内出现自噬泡以及除线粒体以外的细胞器扩张,但胞核正常的嗅觉神经元.结论凋亡参与成年大鼠嗅觉神经元生理性更替以及实验性嗅觉神经元死亡和再生的过程.此外,尚存在自噬型和胞质型神经元死亡.
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倍他米松对大鼠离体嗅感觉神经元cAMP的影响
目的 观察倍他米松对大鼠嗅感觉神经元内环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)的影响,探讨糖皮质激素治疗嗅觉障碍的可能机制.方法 取10只大鼠,提取嗅感觉神经元细胞膜蛋白,加入终质量浓度为0.1 mg/ml和1.0 mg/ml的倍他米松预孵育,采用酶联免疫吸附实验观察不同孵育时间点(5 min和30 min)环核苷酸门控通道(cyclic nucleotide-gated channel,CNG通道)配体cAMP生成量的变化.结果 0.1mg/ml和1.0mg/ml倍他米松可提高大鼠嗅感觉神经元中cAMP生成量,同一时间点两个浓度相比差异具有统计学意义(P值均＜0.05);倍他米松预孵育5 min后即引起cAMP浓度的快速升高,直到30 min仍维持较高水平,同一浓度两个时间点比较差异无统计学意义(P值均＞0.05).结论 倍他米松可使嗅感觉神经元内cAMP生成量增多,且1.0 mg/ml倍他米松的作用大于0.1 mg/ml的倍他米松.糖皮质激素对嗅觉障碍的治疗作用可能与嗅觉信号转导过程中腺苷酸环化酶-环磷酸腺苷通路强化有关.
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嗅觉受体基因和蛋白的研究进展
嗅觉感知的起始是由嗅觉受体( olfactory receptor,OR)被气味分子激活,引起细胞内的信号转导,将气味的化学信号转变成电信号,传到更高的脑部结构,完成气味感知.OR基因属于多基因家族,编码的嗅觉受体蛋白(olfactory receptor protein)属于G-蛋白偶联受体超家族,有7个跨膜区域.嗅觉受体蛋白在嗅觉识别气味及信号传导过程中起着重要的作用.
关键词： 嗅觉受体神经元 受体 有气味性物质/遗传学 嗅觉 信号传导 -
嗅感觉神经元的再生调控及与嗅觉障碍的关系
嗅感觉神经元(olfctory receptor neurons,ORNs)在嗅觉中有重要的作用,且能够不断更新.ORNs的干细胞存在于嗅上皮的球形基底细胞中,ORNs的前体分为三个阶段,每个阶段都是ORNs产生的重要调控点.而对ORNs的调控分子信号主要为两个多肽类生长因子的超家族,这些分子信号对ORNs的再生和保持嗅上皮中适当数量的ORNs都有重要作用.了解ORNs再生的调控机制,研究促进ORNs的再生,可为治疗嗅觉障碍提供一些有效的方法.
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嗅觉神经元凋亡及其与嗅觉障碍关系的研究进展
凋亡是一种不同于坏死的细胞死亡方式.国外近10年来的研究表明:嗅觉神经元在很多种情况下都存在凋亡,凋亡与嗅觉障碍关系密切.随着凋亡研究以及嗅觉神经元凋亡研究的不断深入,可用综合手段干预凋亡的启动或中间环节,使嗅觉神经元细胞的凋亡减少,神经元再生增加,从而有利于治疗与嗅觉障碍相关的疾病.
