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Duchenne型肌营养不良肌肉病变机制研究
Duchenne型肌营养不良(DMD)是一种X连锁隐性遗传的致死性肌病,至今尚无有效治疗方法,尽管人类对DMD致病基因及其产物抗肌萎缩蛋白的研究已有15年之久,然而对抗肌萎缩蛋白缺失如何引起肌肉变性、坏死的具体机制至今仍不清楚,因此有必要对DMD发病机制做进一步研究.目前对DMD的发病机制主要有两种假说,一种是机械损伤假说,另一种是钙稳态失衡假说.
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原发性低钾型周期性麻痹相关离子通道基因突变研究进展
目前已知原发性低钾型周期性麻痹 (hypokalaemic periodic paralysis,HypoPP)与遗传有关,约69.0%与电压门控钙通道α1亚单位基因CACNA1S(1q31-32)突变相关(Ⅰ型),约8.6%与电压门控钠通道α亚单位基因SCN4A(17q23.1-25.3)突变相关(Ⅱ型),22.4%未知.所有的错义突变均位于离子通道电压感受器上带正电荷的精氨酸(Arg),大部分被组氨酸(His)替代,有时被甘氨酸(Gly)、丝氨酸(Ser)替代.从CACNA1S基因编码的钙通道α1亚单位的第Ⅱ和第Ⅳ结构域S4跨膜区发现了Arg528His/Gly、Arg1239His/Gly突变,从SCN4A基因编码的钠通道α亚单位第Ⅱ结构域S4跨膜区发现Arg669His, Arg672His/Gly /Ser突变.突变通道的功能研究发现,突变钙通道出现钙电流密度下降,钙通道激活减慢;突变钠通道失活明显增强,动作电位达到峰值的速率和传导速率减低.该文对HypoPP相关离子通道基因突变及其突变基因的功能进行综述,以利对HypoPP的深入理解.
关键词： 原发性低钾型周期性麻痹 钙通道 钠通道 基因突变 -
致痫剂青霉素对新生大鼠锥体神经元细胞内游离钙离子浓度的影响
神经元异常放电的电生理基础是细胞内外离子的跨膜运动.本文报道应用激光扫描共聚焦显微镜技术观察青霉素(penicillin, PNC)致痫时锥体神经元Ca2+的跨膜流动情况.
关键词： 激光扫描共聚焦显微镜 青霉素 神经元 钙通道 -
有波动性电生理改变的Lambert-Eaton肌无力综合征一例
Lambert-Eaton肌无力综合征(LEMS)系P/Q型电压门控钙通道(P/Q type voltage-gated calcium channel, VGCC)抗体导致神经-肌肉接头突触前膜乙酰胆碱释放量减少的免疫性疾病,其电生理特征改变为低频重复电刺激(LRS)波幅递减,高频刺激(HRS)波幅递增超过60%(Oh)等的标准),或超过100%.
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家族性低钾型周期性麻痹的基因突变与临床特征
目的筛查家族性低钾型周期性麻痹相关基因突变位点,总结该病基因型和临床表型的相关性.方法应用聚合酶链反应(PCR)和DNA测序技术,对14个家族性低钾型周期性麻痹家系中的14例先证者进行候选基因CACNA1S、SCN4A、KCNE3的筛查,阳性者再对其家系中其他患者和健康亲属进行测序分析.结果14个家系中有3个家系其先证者存在已知的低钾型周期性麻痹相关突变(1个家系发生CACNA1S基因R1239H突变,2个家系发生SCN4A基因的R672H突变).进一步对3个突变家系中4例其他患者和34名健康亲属测序分析发现,R1239H突变为完全外显率,R672H突变为不全外显率.同时还发现2种突变在发病年龄和乙酰唑胺的疗效等方面存在差异.结论中国低钾型周期性麻痹患者存在CACNA1S基因R1239H和SCN4A基因的R672H突变,2种突变的临床表型存在差异.
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Cav1.1基因26内含子67位点A/G多态性与甲状腺功能亢进性周期性瘫痪的相关性研究
目的探讨钙通道α1亚基(Cav1.1)基因26内含子-67 A/G多态性与男性甲状腺功能亢进(简称甲亢)性周期性瘫痪(TPP)的相关性.方法采用多聚酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法检测46例男性TPP患者(TPP组)、68例男性甲亢患者(GD组)和72名男性健康对照者(CON组)Cav1.1基因26内含子-67A/G多态性.分析比较此多态位点基因型和等位基因在不同人群中分布的差异.结果(1)TPP组、GD组及CON组AG+GG基因型频率分别为47.83%、14.71%、29.17%,G等位基因频率分别为44.57%、13.24%、27.78%.(2)TPP组AG+GG基因型频率明显高于GD组和CON组(OR=5.32,P＜0.01;OR=2.23,P=0.04),TPP组G等位基因频率明显高于GD组和CON组(OR=5.27,P＜0.01;OR=2.09,P=0.008).结论Cav1.1基因26内含子-67位点A/G多态性与男性TPP有相关性.
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L-钙离子通道参与大鼠黑质致密部多巴胺能神经元暴发式放电模式产生和维持的机制
目的 研究钙离子通道对大鼠黑质致密部(SNc)多巴胺能神经元暴发式放电模式产生和维持的机制.方法 应用全细胞膜片钳的方法,施加N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)诱导神经元放电模式转变,观察并记录其相应放电模式的特点,记录并比较加入10 μmol/L NMDA前后全钙离子流和L-钙电流的变化情况,通过外液加入河豚毒素、维拉帕米、氯化镍后,分析暴发式放电产生和维持与L-钙通道激活之间的联系.结果 加入NMDA后神经元放电模式转变为暴发式放电,该暴发式放电为平台电位及其上的动作电位构成;L-钙通道电流密度峰值在加入NMDA后明显增加,从(2.86±0.26) pA/pF(n =28)增加到(3.75 ±0.18) pA/pF(n =34),差异具有统计学意义(t=7.52,P=0.0028);采用L-钙阻断剂维拉帕米后暴发式放电中的平台电位几乎消失.结论 NMDA能够诱导SNc多巴胺能神经元转变为暴发式放电模式,而L-钙通道参与暴发式放电产生和维持的过程.
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P/Q型钙离子通道与偏头痛
目的 利用硝酸甘油实验性偏头痛大鼠模型探讨P/Q型钙离子通道在偏头痛发病机制中的作用.方法 20只sD大鼠(雌雄各半)随机分为生理盐水对照组和模型组.模型组按Tassorelli Cristina法复制偏头痛大鼠模型(每周1次,连续4次),第4次造模后分别取三叉神经节及三叉颈复合体、大脑额叶组织.RT-PCR及Western-blot法测定P/Q型钙离子通道mRNA及蛋白的表达量,同时用Fluo-3/AM荧光法测定其细胞内钙离子浓度.结果 与对照组相比,模型组大鼠三叉神经节及三叉颈复合体(mRNA:0.472 36±0.049 54;蛋白:0.337 25±0.035 93)和大脑额叶组织(mRNA:0.547 45±0.044 39;蛋白:0.402 13±0.029 83)中的P/Q型钙离子通道在mRNA及蛋白水平均表达上调(t=2.6697、3.1993、3.4398、3.7661,P<0.05),同时细胞内钙离子浓度也明显高于对照组(P<0.05).结论 P/Q型钙离子通道可能通过其表达量的上调参与了偏头痛的发生发展过程.
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P/Q型钙离子通道与偏头痛
目的 利用硝酸甘油实验性偏头痛大鼠模型探讨P/Q型钙离子通道在偏头痛发病机制中的作用.方法 20只sD大鼠(雌雄各半)随机分为生理盐水对照组和模型组.模型组按Tassorelli Cristina法复制偏头痛大鼠模型(每周1次,连续4次),第4次造模后分别取三叉神经节及三叉颈复合体、大脑额叶组织.RT-PCR及Western-blot法测定P/Q型钙离子通道mRNA及蛋白的表达量,同时用Fluo-3/AM荧光法测定其细胞内钙离子浓度.结果 与对照组相比,模型组大鼠三叉神经节及三叉颈复合体(mRNA:0.472 36±0.049 54;蛋白:0.337 25±0.035 93)和大脑额叶组织(mRNA:0.547 45±0.044 39;蛋白:0.402 13±0.029 83)中的P/Q型钙离子通道在mRNA及蛋白水平均表达上调(t=2.6697、3.1993、3.4398、3.7661,P<0.05),同时细胞内钙离子浓度也明显高于对照组(P<0.05).结论 P/Q型钙离子通道可能通过其表达量的上调参与了偏头痛的发生发展过程.
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β淀粉样肽25-35对原代培养的海马神经元电压门控钙通道电流的影响
目的 探讨β淀粉样肽25-35(Aβ25-35)对海马神经元电压门控的钙通道电流(VGCC)的作用.方法 应用全细胞膜片钳技术记录海马神经元上的VGCC,通过设定不同的钳制电压分别记录高电压激活的钙电流(HVA-ICa)和低电压激活的钙电流(LVA-ICa),并观察Aβ25-35对其的影响.结果 分别对原代培养的海马神经元急性胞外给予2μmol/L和10 μmol/L的凝聚态Aβ25-35,在大激活电压下加药后ICa幅度分别是加药前的99.80%±0.02%及100.00%±1.58%,差异没有统计学意义.10 μmol/L凝聚态Aβ25-35预孵育24 h可增大ICa,对照组(未给Aβ25-35)为(24.49±4.35)pA/pF,Aβ25-35组(预孵育24 h)为(46.59±7.15)pA/pF,两组差异有统计学意义(P＜0.05);但Aβ25-35组的膜电容[(14.34±1.74)pF]与对照组[(14.44±0.97)pF]相比差异没有统计学意义.结论 急性给予凝聚态Aβ25-35对VGCC没有影响,24 h预孵育凝聚态Aβ25-35增大了VGCC,而膜电容没有改变,提示凝聚态Aβ25-35可通过对细胞膜上钙通道进行分子调控以增大VGCC.
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中国汉族人群CACNA1A基因CAG重复数目分布特点及其在脊髓小脑性共济失调6型基因诊断中的应用
目的 探讨我国汉族人群CACNA1A基因CAG重复数目分布特点及其在脊髓小脑性共济失调6型(spinocerebellar ataxias type 6,SCA6)基因诊断中的应用.方法 应用"两步PCR法"、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(DPAGE)和测序等方法对300名健康对照及109例无血缘关系的SCA患者进行CACNA1A基因CAG三核苷酸重复数目分析.结果 300名健康对照的CAG重复次数范围为3～18次,以13次常见.在109例SCA患者中,发现1例SCA6患者,其CAG异常重复次数为24次,该患者的母亲和哥哥亦为SCA6患者,临床上均表现为缓慢进展的小脑性共济失调、构音障碍、眼震、轻度的振动及本体觉减退,遗传早现现象较明显.结论 SCA6病例在我国较少见,进行CACNA1A基因突变分析有助于临床诊断."两步PCR法"可提高CACNA1A基因突变分析的效率.
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尼福地平对豚鼠耳蜗功能和噪声性听力损失的影响
目的观察L-型钙通道阻滞药尼福地平对耳蜗功能的影响及其对噪声性听力损失(noise-induced hearing loss,NIHL)的保护作用.方法健康杂种豚鼠40只,随机分为四组:人工外淋巴液组;尼福地平组;人工外淋巴液加噪声暴露组;尼福地平加噪声暴露组.四组动物按分组条件分别行耳蜗外淋巴液灌流,给予噪声暴露或不给噪声暴露,从圆窗记录复合动作电位(compound action potential,CAP)阈值和微音电位(cochlear microphonics,CM)幅值,上述两个指标在灌流前和灌流120分钟各记录一次.结果人工外淋巴液组灌流前后的CAP阈值和CM幅值无显著差异(P＞0.05);尼福地平组灌流后CAP阈值升高、CM幅值下降(P＜0.05).尼福地平加噪声暴露组及人工外淋巴液加噪声暴露组,噪声暴露后较噪声暴露前CAP阈值升高和CM幅值下降(P＜0.05),CAP阈值升高和CM幅值降低程度,前组比后组低(P＜0.01).结论尼福地平可能作用于耳蜗毛细胞上的L-型钙通道,对耳蜗功能有抑制作用并对NIHL有部分保护作用.
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水杨酸钠对大鼠下丘神经元L-型钙通道的影响
目的 了解L-型钙通道在水杨酸钠导致耳鸣的机制中所起的作用.方法 利用全细胞膜片钳技术研究水杨酸钠对急性分离的大鼠下丘神经元L-型钙通道的影响.结果 水杨酸钠抑制L-型钙通道电流(ICa,L),且具有浓度依赖性.水杨酸钠抑制ICa,L的半抑制浓度值为1.99 mmol/L.水杨酸钠不影响ICa,L的电导-电压曲线和稳态激活曲线,水杨酸钠将ICa,L的稳态失活曲线向超极化方向移动8 mV,并且延长ICa,L失活后恢复的时间.结论 水杨酸钠对ICa,L的抑制作用,可能通过减少下丘部位γ-氨基丁酸的释放,从而导致耳鸣.
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L-型电压门控钙通道α1D亚基与内耳功能的关系
电生理学研究表明耳蜗毛细胞去极化介导的钙电流绝大部分由L-型电压门控钙通道α1D亚基介导.α1D亚基的主要作用是控制细胞钙内流和细胞膜去极化,从而使神经突触递质释放而传导神经冲动,与内耳功能关系密切.本文就L一型电压门控钙通道αlD亚基与内耳功能做简要综述.
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豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱敏感性大电导钙依赖性钾通道与L型钙通道共存
目的 研究豚鼠Ⅱ型前庭毛细胞乙酰胆碱(acetylcholine,ACh)敏感性大电导钙依赖性钾通道(big conductance,calcium-dependent potassium channel,BK)激活过程中的钙离子内流机制.方法 健康杂色豚鼠52只,断头后取出前庭终器,经胶原酶IA消化后获取Ⅱ型前庭毛细胞.采用全细胞膜片钳技术检测新鲜单离的Ⅱ型前庭毛细胞ACh-敏感性BK电流对细胞外钙通道阻断剂和激动剂的敏感性.结果 ①细胞外ACh激活一缓慢持久的外向性电流,其反转电位为(-70.5±10.6)mV(-x±s,下同,n=10);-50 mV钳制电压下,100 μmol/L ACh激活电流的幅值为(267±106)pA(n=11).②ACh-敏感性钾电流对细胞外IBTX(iberiotoxin,200 nmol/L)敏感,而细胞外蜂毒明肽(apamin,1 μmol/L)对ACh-敏感性钾电流幅值无抑制作用.③ACh-敏感性BK对细胞外钙通道阻断剂NiCl2敏感,可被细胞外钙通道阻断剂CdCl2强力阻断.NiCl2和CdCl2对ACh-敏感性BK的半数抑制浓度分别为(135.5±18.5)μmol/L(n=7)和(23.4±2.6)μmol/L(n=7).④L型钙通道激动剂(-)-Bay-K 8644激活Ⅱ型前庭毛细胞产生一种与ACh-敏感性BK类似的外向性电流,并能被IBTX强力阻断.结论 Ⅱ型前庭毛细胞中ACh-敏感性BK与细胞膜L型钙通道共存,可能具有重要的生理学作用和意义.
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豚鼠耳蜗各回外毛细胞L型钙通道的分布
目的探讨耳蜗2～4回外毛细胞(outer hair cell,OHC)L型钙通道分布密度.方法豚鼠耳蜗外毛细胞L型钙通道经DM-BODIPY DHP和RH414标记后用激光扫描共聚焦显微镜观察,以DM-BODIPY DHP / RH414荧光比值大小指示L型钙通道密度的高低.结果①应用硝苯地平阻断后,质膜的DM-BODIPY DHP荧光染色明显减弱,表明其钙通道为特异性L型钙通道;②L型钙通道密度从低频区(第4回)向高频区(第2回)有逐渐增加的趋势,方差分析示第4回和第2回OHC之间L型钙通道的分布差异有显著性意义;③OHC质膜不同区域L型钙通道分布差异无显著性意义.结论耳蜗2～4回OHC之间L型钙通道分布的差异可能是耳蜗音位分布图的分子机制之一.
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硝普钠对豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流作用的实验研究
目的探讨一氧化氮供体--硝普钠(sodium nitroprusside,SNP)对豚鼠单离耳蜗外毛细胞钙电流的影响及作用机制.方法利用急性分离的豚鼠耳蜗外毛细胞,在全细胞膜片钳电压钳记录技术下,通过分离离子电流成分的方法,记录豚鼠耳蜗外毛细胞全细胞钙电流.结果 SNP对内向钙电流有抑制作用,在钳制电位为-60 mV,刺激电压为+10 mV的条件下,10 mmol/L的SNP能抑制(61.12±1.99)%的内向钙电流(±s,n=5).从5～8个细胞得到的量效关系曲线中,其半数作用浓度为1.9 mmol/L,大抑制浓度为100 mmol/L,斜率为0.98.作用的机制为SNP可选择性地阻断外毛细胞膜上的L-型钙通道(n=6).结论 SNP作为一氧化氮的一种供体,能影响豚鼠耳蜗外毛细胞的生理功能,是通过阻断外毛细胞L-型钙通道电流的内流来实现的.
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小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位分析
目的分析小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位的类型.方法手术分离新生小鼠的耳蜗螺旋神经节细胞进行培养,24 h后提取RNA.逆转录后获得螺旋神经节细胞cDNA,根据电压依赖性钙通道7种亚单位序列设计的引物进行聚合酶链反应扩增,通过聚合酶链反应结果分析和DNA测序确定螺旋神经节细胞表达的亚单位类型.结果逆转录聚合酶链反应扩增出α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的片段,测序进一步证明小鼠螺旋神经节细胞中有这几种亚单位的存在.结论小鼠螺旋神经节细胞中有α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的表达.α1D和α1E亚单位的共表达证明在哺乳动物的螺旋神经节细胞中有L型和R型电压依赖性钙通道.
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小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位分析
目的分析小鼠螺旋神经节细胞电压依赖性钙通道亚单位的类型.方法手术分离新生小鼠的耳蜗螺旋神经节细胞进行培养,24 h后提取RNA.逆转录后获得螺旋神经节细胞cDNA,根据电压依赖性钙通道7种亚单位序列设计的引物进行聚合酶链反应扩增,通过聚合酶链反应结果分析和DNA测序确定螺旋神经节细胞表达的亚单位类型.结果逆转录聚合酶链反应扩增出α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的片段,测序进一步证明小鼠螺旋神经节细胞中有这几种亚单位的存在.结论小鼠螺旋神经节细胞中有α1D、α1E、α2/δ、β1和β3亚单位的表达.α1D和α1E亚单位的共表达证明在哺乳动物的螺旋神经节细胞中有L型和R型电压依赖性钙通道.
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钙通道阻滞药对耳蜗功能的影响
在耳蜗水平,钙(calcium,C2+)与耳蜗功能密切相关.许多内耳疾病与细胞Ca2+超载"有关.通过钙通道阻滞药阻断钙通道,减轻内耳毛细胞Ca2+超载"可能达到部分保护耳蜗功能的目的.现就钙通道阻滞药对耳蜗功能的影响进行简要综述.
