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Cox7a2荧光载体构建及其对小鼠支持细胞细胞色素C氧化酶活性的影响
目的 构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,研究其在小鼠睾丸支持细胞(TM4)中的表达及对细胞色素C氧化酶(COX)活性的影响.方法 应用RT-PCR方法从TM4细胞克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点将Cox7a2克隆到pEYFP-C1载体,经酶切、测序及蛋白印迹等技术进行鉴定,并将重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2转染TM4细胞后6、12、24、48 h,采用分光光度计测定COX活性.结果从TM4细胞克隆到Cox7a2基因完整的编码序列,大小为252 bp.构建pEYFP-C1-Cox7a2表达载体,经酶切、测序鉴定证实克隆正确,转染TM4细胞的效率达70%,融合蛋白表达产物相对分子质量为37 000.重组质粒转染后6、12、24、48 h时COX活性分别为(0.642±0.051)、(0.542±0.049)、(0.311±0.021)和(0.216±0.010)U/mg,不转染组和转染空载体组分别为(0.714±0.064)、(0.653±0.031)U/mg.与不转染组相比,重组质粒转染后12、24、48 h组COX活性显著降低(P＜0.05).结论重组质粒pEYFP-C1-Cox7a2 载体成功构建.Cox7a2基因对TM4细胞COX活性具有抑制作用,可能对调控COX活性发挥重要作用.
关键词： 电子传递复合物Ⅳ Cox7a2 pEYFP-C1载体 TM4支持细胞 COX活性 -
Cox7a2和ATP50在原代培养小鼠Leydig细胞和人体不同器官的表达研究
目的 研究线粒体呼吸链相关基因Cox7a2,ATP50在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞和人体各器官组织中的表达特征.方法 原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并鉴定,利用RT-PCR方法 研究Cox7a2,ATP50在Leydig细胞中的表达.利用PCR方法 研究Leydig在人体各重要脏器组织的表达谱.结果 Cox7a2,ATP50在原代小鼠睾丸Leydig细胞中表达,Cox7a2和ATP50在各个脏器旱现出不同的表达特征.结论 Cox7a2,ATP50表达在原代小鼠睾丸Leydig细胞中,研究Cox7a2,ATP50在人体各器官的表达特点,为基因的功能研究奠定了前期基础.
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Cox7a2对睾酮合成及StAR、P450scc和3β-HSD蛋白表达影响研究
目的 研究Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leyidg细胞中过表达对LH诱导的睾酮合成及对StAR(睾酮合成调节关键蛋白),P450scc(胆固醇侧链裂解酶),3β-HSD(3β-羟基甾脱氢酶)蛋白表达的影响.方法 构建Cox7a2荧光表达载体,转染TM3小鼠睾丸Leydig细胞,融合蛋白表达及LH诱导刺激后,ELISA测定细胞上清液中睾酮含量,Western blot检测StAR蛋白、P450scc和3β-HSD酶的表达变化.结果 Cox7a2在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中过表达抑制LH诱导的睾酮合成,降低StAR蛋白的表达,对P450scc和3β-HSD的蛋白表达没有明显影响.结论 在TM3小鼠睾丸Leydig细胞中,Cox7a2至少通过抑制类固醇快速调节蛋白StAR的表达,进而抑制LH诱导的睾酮合成.
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Cox7a2荧光载体构建及其在小鼠睾丸Leydig细胞表达和定位研究
目的构建Cox7a2的荧光表达载体,研究其在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达和定位.方法原代培养小鼠睾丸Leydig细胞并利用3 β-HSD染色法鉴定,应用PCR方法研究Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞中的表达.利用Bgl Ⅱ和EcoR Ⅰ酶切位点把Cox7a2克隆到pEYFP-N1.细胞转染和细胞荧光显微镜技术观察YFP-Cox7a2定位.结果Cox7a2表达在原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中.绿色荧光的YFP-Cox7a2和红色荧光的线粒体标记物-Mitotracker有完全的共定位.结论Cox7a2在小鼠睾丸Leydig细胞表达,成功构建Cox7a2真核荧光蛋白表达载体,明确YFP-Cox7a2定位在Leydig细胞的线粒体.这些结果将对老年男性睾丸间质细胞合成功能障碍的研究提供重要的信息.
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重组蛋白Cox7a2原核表达及鉴定
目的:从原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中克隆Cox7a2基因,构建Pgex4t-1-Cox7a2载体,表达和鉴定重组蛋白.方法:应用RT-PCR方法从原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞中克隆Cox7a2,利用BamH I和EcoR I酶切位点把Cox7a2克隆到pGEX4T-1载体,酶切和测序鉴定后,诱导重组蛋白的表达,进行纯化后,利用蛋白免疫印迹进行鉴定.结果:从原代培养的小鼠睾丸Leydig细胞克隆到Cox7a2完整的编码序列,构建了pGEX4T-1-Cox7a2载体,表达了预期相对分子质量的融合蛋白,并经免疫印迹检测鉴定.结论:成功克隆Cox7a2,表达纯化了其融合蛋白,为基因的功能研究奠定了前期基础.
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Cox7a2在TM3睾丸Leydig细胞中表达,定位及与ERK1/2磷酸化相关性研究
目的:研究Cox7a2的荧光表达载体在TM3睾丸Leydig细胞中的表达和定位及对ERK1/2磷酸化的影响.方法:将Cox7a2克隆到pEYFP-N1.细胞转染和细胞荧光显微镜观察其在TM3细胞中的表达和定位,Western blot检测ERK1/2磷酸化水平.结果:在TM3细胞中,绿色荧光YFP-Cox7a2和红色荧光线粒体标记物Mitotracker有完全的共定位,过量表达YFP-Cox7a2能引起ERK1/2磷酸化水平增高.结论:成功表达了YFP-Cox7a2融合蛋白,确认了其在TM3细胞的线粒体定位.YFP-Cox7a2过表达和ERK1/2磷酸化水平有联系,为探讨Cox7a2对TM3细胞睾酮分泌及其相关信号传导通路的影响奠定了基础.
