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分泌表达PR39重组腺相关病毒对缺氧鸡胚促血管生成的影响
目的 探讨腺相关病毒(AAV)介导的融合基因NT4-TAT-His-PR39对缺氧人脐静脉内皮细胞株ECV304内缺氧诱导因子1α(HIF-1α)表达的影响及其对缺氧环境鸡胚血管生成的影响.方法 PCR技术和T载体克降法克隆PR39基因,将编码PR39、穿膜肽TAT、6×His及NT4信号肽四个基因片段相连.磷酸钙沉淀法获得重组携带NT4-TAT-His-PR39的从V载体,然后AAV-PR39感染ECV304,免疫细胞化学检测ECV304胞内6×His表达情况.在1%O2条件培养ECV304,免疫细胞化学测定AAV-PR39组和PBS组胞内HIF-1α蛋白表达.30只鸡胚随机分为从V-PR39组、EV组和PBS组(各组n=10),分别在鸡胚尿膜囊(CAM)上加AAV-PR39、EV、PBS,然后每组各取5只鸡胚分别在低氧(5%O2)和常氧(21%O2)条件培养.图像软件Image Pro Plus(IPP)分析CAM血管密度.结果 AAV-PR39组ECV304中检测到6×His表达.低氧环境下,AAV-PR39组ECV304中HIF-1α蛋白表达明显高于PBS组,AAV-PR39组CAM血管密度明显大于其他两组.结论重组携带NT4-TAT-His-PR39的AAV载体能在ECV304中分泌表达,并提高缺氧细胞HIF-1α蛋白表达水平.重组AAV载体显著促进缺氧CAM血管生成,而对常氧CAM无此作用.
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rAAV-PR39-ADM防治大鼠脑缺血／再灌注损伤的研究
目的：探讨重组腺相关病毒协同表达双基因：抗菌肽（PR39）和肾上腺髓质素（adrenomedullin，ADM），即 rAAV-PR39-ADM对大鼠脑缺血／再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤的治疗作用。方法离体实验：人脐静脉内皮细胞培养，行血管成型实验。在体实验：建立大鼠脑I／R模型（脑缺血2 h后再灌注）。SD大鼠随机分为：Sham组、生理盐水组（I／R＋NS ）、空病毒组（I／R ＋AAV ）及治疗组（I／R ＋rAAV-PR39-ADM组）。I／R组，再灌注24 h后股静脉分别给予等量生理盐水、空病毒及rAAV-PR39-ADM。术后1、2、3、4周，行头颅MRI、神经功能缺损评分、TTC染色及HE染色等方法评价 rAAV-PR39-ADM对脑 I／R损伤的疗效。结果离体实验中，rAAV-PR39-ADM同对照及空病毒组相比，有明显的促血管成型作用。在体实验中，头颅MRI 检查证实模型制备成功。与Sham组相比，各时间点I／R组的神经功能缺损评分及脑组织梗塞的体积均明显增高（P＜0.01），I／R组术后即刻神经功能缺损评分差异无统计学意义（P ＞0.05）。与生理盐水组及空病毒组相比，治疗组各时间点神经功能缺损评分及梗塞体积均明显减小（P＜0.01），空病毒组与生理盐水组比较，梗塞面积及神经功能缺损评分差异无统计学意义（P＞0.05）。HE染色显示，治疗组的神经元细胞数目与生理盐水组和空病毒组相比明显丰富，缺血区新生血管明显增多。结论 rAAV-PR39-ADM可能通过促进血管新生，改善脑I／R后局部供血及侧枝循环，保护神经元，促进血管再生，减轻I／R脑损伤。
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携抗菌肽PR39基因重组腺病毒的构建及抗胞内伤寒菌研究
目的 构建抗菌肽PR39基因腺病毒表达载体,观察其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌活性.方法 PCR扩增抗菌肽PR39成熟肽基因,插入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,经PmeI线性化后与腺病毒骨架(pAdEasy-1)共转化大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组产生重组腺病毒载体(pAd-PR39).重组腺病毒载体经PacI线性化后转染293细胞,包装出重组腺病毒(Ad-PR39).利用重组腺病毒感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7,采用RT-PCR和免疫细胞化学检测目的基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测.结果 先后构建了携抗菌肽PR39基因的穿梭载体和重组病毒载体,包装出重组腺病毒,并成功感染小鼠巨噬细胞RAW264.7.感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7能有效表达抗菌肽PR39.与对照(10.8±2.1 CFU/cell)相比,感染重组腺病毒的小鼠巨噬细胞RAW264.7具有更强的杀灭胞内伤寒菌的能力(7.2±1.8 CFU/cell). 结论 构建的重组腺病毒能够感染小鼠巨噬细胞RAW264.7并发挥抗菌作用,为抗菌肽PR39在胞内菌感染基因治疗中的应用奠定了实验基础.
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靶向巨噬细胞表达抗菌肽PR39基因抗胞内结核分枝杆菌的研究
目的:观察靶向巨噬细胞表达抗菌肽 PR39 基因的腺病毒在小鼠巨噬细胞RAw264.7和小鼠肺部的表达及抗结核分枝杆菌活性.方法:利用携巨噬细胞启动子和抗菌肽 PR39 基因的重组腺病毒感染体外培养的小鼠巨噬细胞RAW264.7和小鼠肺部,采用荧光免疫技术检测PR39 在小鼠肺部表达,并对其抗菌活生进行初步检测.结果:重组腺病毒能够成功感染 RAW264.7,并有效表达抗菌肽PR39.与对照相比,感染重组腺病毒的RAW264.7具有更强的杀灭胞内BCG的能力,同时,重组腺病毒能够成功感染小鼠肺部,并表达目的基因.与对照相比,感染重组腺病毒的小鼠肺部的 BCG 活菌数明显减少.结论:靶向巨噬细胞表达抗菌肽 PR39 基因在体内外均能够发挥抗胞内 BCG 作用,为抗菌肽 PR39 在胞内菌感染基因治疗中的应用奠定了实验基础.
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抗菌肽PR39真核表达载体的构建及其在巨噬细胞中的表达和抗菌作用
目的 构建抗菌肽PR39的真核表达载体,转染后观察PR39在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达及抗菌作用.方法 采用拼接PCR法合成抗菌肽PR39基因,克隆到真核表达载体pIRES2-GFP中,经鉴定后用阳离子脂质体转染小鼠巨噬细胞RAW264.7,通过RT-PCR和免疫荧光法检测目的 基因的表达,并对其抗菌活性进行初步检测.结果 成功构建了抗菌肽PR39的真核表达载体pIRES2-GFP/PR39,并能在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达抗菌肽PR39.表达抗菌肽PR39的巨噬细胞杀灭和清除胞内菌的能力明显增强.结论 抗菌肽PR39基因能够在小鼠巨噬细胞RAW264.7中表达并发挥抗菌作用.
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NT4-TAT-His-PR39融合基因cDNA的构建及意义
目的:探讨PR39对急性缺血心肌的保护作用,构建可分泌表达PR39的神经生长因子4(NT4)-TAT-His-PR39融合基因cDNA.方法:采用互为模板、引物的PCR技术,制备两端含有酶切位点的PR39 cDNA片段.通过常规分子生物学方法,将其与编码NT4信号肽及引导肽、TAT及6×His基因序列用T4 DNA连接酶相连,将NT4-TAT-His-PR39装入质粒pBV220中.结果:融合基因NT4-TAT-His-PR39的长度为421 bp,限制性内切酶切图谱显示,目的带的大小略超过marker的400 bp的位置,证实已经成功地将PR39 cDNA重组到NT4-TAT-His序列的下游.基因测序结果及DNAsis软件分析结果表明,NT4-TAT-His-PR39的全序列与实验设计的序列完全一致.结论:成功地构建能分泌表达PR39、并具穿膜功能和标签的融合基因NT4-TAT-His-PR39.
