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睡眠因子1负性调控内皮祖细胞迁移的体外研究
目的 探讨睡眠因子1(Slfn1)对内皮祖细胞(EPC)迁移的影响及其机制.方法 实验分为大鼠Slfn1腺病毒载体组(Ad-Slfn1组)、腺病毒阴性对照组(Ad-对照组)、大鼠发夹状RNA干扰Slfn1组(ShRNA-Slfn1组)、发夹状RNA阴性对照组(ShRNA-对照组)、空白对照组(未给予任何处理的内皮祖细胞).分离培养大鼠骨髓源性EPC,用构建好的大鼠Slfn1腺病毒载体、发夹状RNA干扰Slfn1质粒及相应的对照质粒分别转染EPC,采用逆转录聚合酶链反应和蛋白印迹法检测细胞Slfn1、Cyclin D1的mRNA和蛋白表达水平,Boyden小室检测细胞迁移能力,流式细胞技术检测细胞周期.结果 (1)质粒转染效率的检测结果:Ad-Slfn1组EPC中Slfn1mRNA表达水平高于Ad-对照组(P＜0.05),Slfn1蛋白表达水平亦高于Ad-对照组(P＜0.05).而ShRNA-Slfn1组EPC中Slfn1mRNA表达水平低于ShRNA-对照组(P＜0.05),Slfn1蛋白表达水平亦低于ShRNA-对照组(P＜0.05).(2)EPC迁移能力的检测结果:Ad-Slfn1组EPC迁移数目少于Ad-对照组(P＜0.05).而ShRNA-Slfn1组EPC迁移数目多于ShRNA-对照组(P＜0.05).(3) EPC细胞周期分布情况的检测结果:Ad-Slfn1组EPC分布于G1期的数目多于Ad-对照组(P＜0.05),而分布于S期的数目低于Ad-对照组(P＜0.05).而ShRNA-Slfn1组EPC分布于G1期的数目少于ShRNA-对照组(P＜0.05),分布于S期的数目则多于ShRNA-对照组(P＜0.05).(4) Cyclin D1 mRNA和蛋白表达水平的检测结果:Ad-Slfn1组Cyclin D1mRNA表达低于Ad-对照组(P＜0.05),Cyclin D1蛋白表达水平亦低于Ad-对照组(P＜0.05).而ShRNA-Slfn1组mRNA表达水平高于ShRNA-对照组(P＜0.05),Cyclin D1蛋白表达水平亦高于ShRNA-对照组(P＜0.05).结论 Slfn1可通过下游靶点Cyclin D1负性调控内皮祖细胞的迁移能力.
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Slfn1通过下调Cyclin D1抑制内皮祖细胞的黏附功能
目的 探讨睡眠因子1(Slfn1)对内皮祖细胞(EPC)黏附功能的影响.方法 实验分为空白对照组(未给予任何处理的EPC,N-control组)、腺病毒阴性对照组(Ad-control组)、Slfn1腺病毒载体组(Ad-Slfn1组)、发夹状RNA阴性对照组(ShRNA-control组)、发夹状RNA Slfn1干扰组(ShRNA-Slfn1组).分离培养大鼠骨髓源性EPC,用ShRNA-control质粒、Ad-Slfn1及相应的对照质粒分别转染EPC,采用Western blot检测细胞Slfn1及Cyclin D1表达,将EPC接种在预先铺好纤维连接蛋白的培养板中,观察其黏附功能.用流式细胞仪检测细胞周期.结果 ShRNA-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显低于ShRNA-control组,Ad-Slfn1组Slfn1蛋白的表达明显高于Ad-control组,说明转染有效.用ShRNA-Slfn1减弱EPC Slfn1基因的表达明显增强EPC的黏附能力,过表达Slfn1基因则明显抑制EPC的黏附能力.细胞周期检查结果显示,降低EPC Slfn1基因的表达,EPC的细胞周期进入到S期细胞明显增多,过表达Slfn1基因使EPC的细胞周期停止在G1期.Western blot检测结果发现,ShRNA-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达明显高于ShRNA-control组,而Ad-Slfn1组Cyclin D1的蛋白表达则明显低于Ad-control组.结论 Slfn1通过下游靶点Cyclin D1负性调控EPC的黏附功能.
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大鼠shRNA-Slfn1重组腺病毒载体的构建与鉴定
目的：构建大鼠睡眠因子1（ Slfn1）基因的发夹状RNA质粒，并进行腺病毒载体包装。方法：根据Rat slfn1基因的转录本设计并合成3个干扰RNA靶点ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3），并将单链的引物退火成双链oligo序列，连接入双酶切线性化的RNA干扰载体（ pDKD-CMV-U6-shRNA）的U6启动子下游，替换掉原来的 ccdB 基因；利用 Admax 系统，将3种目的穿梭质粒分别与腺病毒骨架质粒共转染到HEK293细胞中重组获得病毒后进行小量扩增及病毒滴度测定；利用Slfn1过表达腺病毒质粒中目的基因携带Flag标签，通过Western Blot检测Slfn1过表达腺病毒质粒与靶点质粒共转染293T细胞中Flag表达，观察靶点质粒对Slfn1表达的影响。结果：经菌落PCR鉴定获得阳性克隆并测序验证正确，表明构建质粒成功；腺病毒包装ShRNA-Slfn1（1）、ShRNA-Slfn1（2）及ShRNA-Slfn1（3）的病毒滴度分别为1.0×1014 ifu/L，2.5×1014 ifu/L，6.3×1013 ifu/L，Western Blot证实ShRNA-Slfn1（1）及ShRNA-Slfn1（3）能显著降低转染293T细胞中Flag的表达，确定shRNA-Slfn1（1）及shRNA-Slfn1（3）为目的质粒。结论：成功构建了大鼠shRNA-slfn1的重组腺病毒载体。
