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内脏脂肪素对内皮祖细胞致炎作用及相关机制的研究
目的：研究内脏脂肪素（Visfatin）对人内皮祖细胞（EPCs）的致炎作用及可能机制。
方法：体外分离培养人EPCs 2Visfatin刺激EPCs 3吡咯烷二硫代氨基甲酸盐（PDTC）对Visfatin刺激EPCs的作用。 -
葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶活性的影响
目的 研究葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞(EPCs)增殖、凋亡及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.方法 采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,经含血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和10%胎牛血清的M199培养基培养7 d,贴壁细胞鉴定为EPCs.细胞同化后给予葡萄糖浓度5.5 mmol/L(正常对照组)、30 mmol/L(糖浓度固定组)和20或40 mmol/L(平均浓度为30 mmol/L,波动间期为3 h,糖浓度波动组).干预6、12、24、48、96 h后,采用WST-1细胞增殖检测试剂盒处理细胞,酶标仪检测细胞增殖;以AnnexinV-FITC凋亡检测试剂盒处理细胞,流式细胞仪检测细胞凋亡;以一氧化氮合酶检测试剂盒处理细胞,荧光酶标仪检测eNOS活性.结果 当平均浓度相同时,与糖浓度固定组相比,糖浓度波动组抑制EPCs增殖及eNOS活性的作用显著增强(P值均＜0.05),凋亡率显著增高(P＜0.05);糖浓度固定组与糖浓度波动组的增殖率、凋亡率、eNOS活性的差值与干预时间呈正相关(r值分别=0.937、0.927、和0.951,P值均＜0.05).结论 葡萄糖浓度波动作为独立因素促进EPCs的凋亡、抑制EPCs的增殖并降低eNOS的活性.EPCs对葡萄糖浓度波动的适应性差.
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转化生长因子α对人内皮祖细胞分化功能的影响
目的 研究转化生长因子α(TGF-α)对人内皮祖细胞(EPC)分化功能的影响并初步揭示其作用机制.方法 从健康人外周血中分离EPC,分别用含0、1、10 μg/L浓度的TGF-α完全培养基诱导培养.观察各组中EPC分化的影态变化,并利用流式细胞术检测各组EPC培养分化过程中CD34+/CD133+和CD31 +/vWF+阳性细胞率,Real-time PCR方法测定各组中EPC分化的内皮细胞特异性基因内皮型一氧化氮合酶(eNOS)和Flk-1/KDR表达差异,并通过测定各组中一氧化氮(NO)含量变化比较EPC分化内皮细胞的功能,Western Blot检测各组EPC分化中TGF-α受体EGFR和血管内皮生长因子(VEGF)的表达.结果 用TGF-α诱导培养分离的人EPC,细胞形态能够更快地由干细胞球形分化成梭形;流式细胞仪检测发现与空白对照组相比,1、10 μg/L TGF-α组中3天时EPC标记CD34 +/CD133+阳性率和7天时分化的内皮细胞标记CD31 +/vWF+阳性率均显著增高,差异有统计学意义(P＜0.05);Real-time PCR检测各TGF-α组EPC分化的内皮细胞特异性基因eNOS和Flk-1/KDR表达量也显著上升(P＜0.05);1、10 μg/L TGF-α诱导培养组中EPC分化的内皮细胞分泌NO含量显著升高(P＜0.05);1、10μg/L TGF-α诱导培养能够显著促进EPC分化过程中EGFR和VEGF的表达(P＜0.05).结论 TGF-α能够显著促进人EPC的增殖分化及分化内皮细胞的功能,并通过与受体EGFR结合刺激VEGF表达发挥作用.
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原花青素单一活性成分 B2对高糖作用下人内皮祖细胞的保护作用
目的：研究原花青素单一活性成分B2（PC－B2）对高糖环境下人内皮祖细胞（EPCs）的保护作用及其作用机制。方法：从健康人外周血中分离诱导培养人EPCs，并进行鉴定。将EPCs分为control组（ PBS处理）、高渗对照组（25 mmol／L甘露醇处理）、高浓度30 mmol／L葡萄糖作用组以及不同浓度（2、10和50 mg／L） PC－B2与30 mmol／L葡萄糖共处理组。使用CCK－8法检测各组中EPCs 活力的变化；同时检测各组EPCs 中乳酸脱氢酶（ LDH）、丙二醛（ MDA）、超氧化物歧化酶（ SOD）和还原型谷胱甘肽（ GSH）水平；ELISA方法检测各组EPCs上清中一氧化氮（NO）、内皮素－1（ET－1）、细胞间黏附分子－1（ICAM－1）和血管细胞黏附分子－1（VCAM－1）的含量变化；流式细胞术检测各组中EPCs活性氧簇（ ROS）生成和凋亡率变化；Western blot检测血管内皮生长因子（ VEGF）和血管内皮生长因子受体－2（ VEGFR－2）的表达情况。结果：与control组相比，高糖作用组中人EPCs的活力显著下降（ P＜0．05）；LDH漏出量以及MDA、ET－1、ICAM－1和VCAM－1含量均显著升高（P＜0．05）；而SOD和GSH活性以及NO含量显著降低（ P＜0．05）；细胞中ROS含量和凋亡率显著上升（ P＜0．05）；EPCs中VEGF和VEGFR－2表达量显著降低（P＜0．05）。与高糖作用组相比，不同浓度PC－B2作用组EPCs活力均明显回升（P＜0．05）；LDH漏出量以及MDA、ET－1、ICAM－1和VCAM－1含量均逐渐下降（ P＜0．05）；SOD和GSH活性以及NO含量均显著上升（ P＜0．05）；细胞中ROS生成和凋亡率逐渐下降（ P＜0．05）；而EPCs中VEGF和VEGFR－2表达量也随之逐渐上升，并具有浓度依赖性（ P＜0．05）。结论： PC－B2能够提升高糖作用下人EPCs活力，减少高糖引起的氧化损伤，恢复EPCs正常功能，降低高糖诱导的炎症因子和细胞凋亡，从而对人EPCs发挥保护作用，并可通过诱导VEGFR－2和VEGF表达发挥作用。
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脂联素对高糖刺激下内皮祖细胞的作用及其可能的作用机制
目的:研究脂联素(adiponectin,APN)对高糖刺激下内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)的作用,并探讨其可能的机制.方法:密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,经含血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子和100 ml/L胎牛血清的M199培养基培养7d,贴壁细胞进行形态学、流式细胞仪测细胞分子标志物(CD34、CD133和KDR)和激光共聚焦倒置显微镜下观察培养细胞摄取ac-LDL和结合UEA-I经何种方法签定为EPCs.细胞同步化后,将其随机分为7组:正常糖浓度对照组(5.5 mmol/L)、高渗对照组(5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇及其浓度)、高糖(30mmol/L)组及高糖APN干预组(30 mmol/L葡萄糖合并APN,1.25、2.5、5、10μ g/ml).干预48 h后,分别采用MTT比色法、Transwell小室检测EPCs的增殖、迁移；以Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒处理细胞,流式细胞仪检测EPCs的凋亡；用荧光探针(DCFH-DA)检测法进行细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)检测.结果:①经密度梯度离心法分离出的外周血单个核细胞培养7d后,细胞集落增加明显,梭形细胞增多并呈交叉性生长；用激光共聚焦倒置显微镜观察,细胞摄取DiI-acLDL呈红色荧光,摄取FITC-UEA-I呈绿色荧光,摄取DiI-acLDL并结合FITC-UEA-I的细胞呈黄色荧光,流式细胞仪分析结果提示:细胞表达KDR(92.32％)、CD133(10.7％)、CD34(23.3％),证实培养的细胞是正在分化的EPCs.②随着糖浓度的增高,EPCs的增殖能力下降,凋亡、ROS水平增加(P＜0.01)；当糖浓度为30 mmol/L与50 mmol/L时,两者相比对EPCs的影响无统计学差异.③与正常糖浓度对照组相比,高渗对照组EPCs的增殖、迁移、凋亡和ROS水平无统计学差异.在30 mmoL/L葡萄糖条件下,EPCs的数量和迁移功能较正常对照组明显下降,细胞凋亡增多,不同浓度APN干预后能明显提高高糖损伤后EPCs的功能(P＜0.05,P＜0.01),并随着浓度的增加,EPCs的增殖与迁移能力增高,凋亡、ROS水平下降(P＜0.01).结论:①与对照组相比,高糖干预可导致EPCs增殖能力下降,细胞凋亡增多；②高糖干预后加入APN,EPCs的增殖、迁移能力恢复,细胞凋亡减少,并在一定范围内,其作用随浓度的增加而增强；③高糖可以引起EPCs功能受损,其作用机制可能与ROS水平升高有关；而APN可以通过降低高糖引起的ROS水平,保护EPCs功能；渗透压对EPCs无影响.
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葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞氧化应激的影响
目的 观察葡萄糖浓度波动对人外周血内皮祖细胞(EPCs)活性氧水平的影响.方法 统采用密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,培养7 d后,收集贴壁细胞,进行FITC-UEA-I、DiI-acLDL双染色鉴定,并用流式细胞术检测细胞的表而标志CD34、CD133和血管内皮生长因子受体-2.EPCs给予不同浓度波动幅度(0、10、20 mmol/L)、不同浓度波动间期(3、6、12 h)、不同平均浓度(20、25、30 mmol/L)的葡萄糖,培养一定时间(6、12、24、48、96 h)后,以氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯染色细胞,用流式细胞术检测细胞内平均荧光强度(MFI).结果 葡萄糖浓度波动幅度越大、浓度波动间期越小、平均浓度越高,细胞内MFI越高(P<0.05).平均浓度对MFI的影响随时间减小;而浓度波动对MFI的影响随时间增大(P<0.05).结论 葡萄糖浓度波动在葡萄糖所致人外周血EPCs慢性氧化应激中起重要作用.
