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胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性抗肿瘤免疫反应的体外研究
目的 观察人胰腺癌Capan-2细胞总RNA转染的树突细胞(DCs)所诱导的抗肿瘤免疫反应.方法 从6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs.使用电穿孔法将Capan-2细胞总RNA及MUC4 mRNA分别转染DCs.应用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测转染后DCs的存活率.采用蛋白质印迹法检测DCs中MUC4 mRNA的表达.使用IFN-γ酶联免疫法检测DCs诱导的细胞毒T淋巴细胞(CTLs)的活化反应.采用51Cr标准细胞毒实验检测DCs诱导的抗原特异性CTLs对体外胰腺癌细胞的杀伤效应.结果 Capan-2细胞总RNA转染的DCs(DC-Capan-2-total RNA)的存活率呈时间依赖性下降,转染后96 h的存活率降低至60.8％,而转染MUC4 mRNA的DCs(DC-MUC4 mRNA)的存活率稳定在80.0％左右,两转染组DCs的差异具有统计学意义(P＜0.05).DC-Capan-2-total RNA的MUC4蛋白表达量亦显著低于DC-MUC4 mRNA(P＜0.05).DC-Capan-2-total RNA诱导的CTLs 24 h IFN-γ释放量为(89.34±3.85) U/ml,DC-MUC4 mRNA为(21.77±2.14) U/ml,两转染组的差异有统计学意义(P＜0.05).DC-Capan-2-total RNA诱导的特异性CTLs能够有效识别和杀伤HLA-A2 +/MUC4+的Capan-2细胞及HLA-A2 +/MUC4-的PANC1细胞,而不能有效识别和杀伤HLA-A2-/MUC4-的MiaPaCa-2细胞和HLA-A2-/MUC4+的AsPC-1细胞.结论 胰腺癌细胞总RNA转染的DCs较单个胰腺癌相关抗原转染的DCs能诱导出更加显著的CTLs抗肿瘤免疫反应,但受到MHC Ⅰ类抗原递呈的限制.
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胰腺癌相关抗原MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的体外研究
目的 研究人胰腺癌MUC1与survivin mRNA联合转染树突细胞(DC)体外激发特异性细胞毒T淋巴细胞(CTL)的能力,为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据.方法 自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养并鉴定DC.常规培养人胰腺癌细胞株MiaPaCa-2,采用RT-PCR方法扩增MUC1和survivin mRNA.应用电穿孔法将两种mRNA单独或联合转染DC,分别命名为DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1+ survivin.采用实时定量PCR法检测DC的MUC1、survivin mRNA表达;四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测DC存活率;使用混合细胞培养法检测转染DC体外刺激自体T淋巴细胞的增殖能力;应用ELISA法检测转染DC体外激发抗原特异性CTL释放Th1型细胞因子IL-2、IL-10、granzyme B、IFN-γ的水平.结果 成功获得成熟的DC,成熟DC的表面标志物CD40、HLA-DR、CD83和CD86的阳性表达率分别为34.31％、50.21％、89.17％和73.62％.DC-MUC1的MUC1 mRNA表达量为36.24±5.17;DC-survivin的survivin mRNA表达量为34.53±4.02;DC-MUC1+survivin的MUC1、survivin mRNA表达量分别为31.79±4.26和14.67±2.96,显著低于单转染的DC(P值均＜0.05).DC-MUC1+ survivin的存活率呈现时间依赖性下降,96 h时的存活率显著低于单转染DC(50.21％比80％左右,P值均＜0.05).当作为刺激细胞的DC和作为效应细胞的T淋巴细胞比例为1∶10、1∶20时,DC-MUC1+ survivin刺激自体T细胞的增殖指数显著高于单转染DC,差异有统计学意义(P值均＜0.05);而比例为1∶40、1∶80时的增殖指数差异无统计学意义.当DC∶T为1∶10孵育14 d时,DC-MUC1、DC-survivin、DC-MUC1+survivin的IL-2水平分别为(892.73±32.90)、(713.62±56.37)、(1884.37±95.21) pg/ml;granzyme B水平分别为(501.62±12.30)、(203.84±12.55)、(1193.15±86.04) pg/ml;IFN-γ水平分别为(981.50±47.82)、(696.05±41.66)、(2237.94±189.55) pg/ml.DC-MUC1+ survivin显著高于单转染的DC,差异有统计学意义(P值均＜0.05);而分泌的IL-10的差异无统计学意义.结论 MUC1与survivin mRNA联合转染的DC较单一抗原转染的DC具有更强的体外特异性CTL激发能力.
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脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒RNA 转染人肝癌细胞中的应用效果比较
目的：比较脂质体转染法与电转染法在丙型肝炎病毒（ HCV ） RNA转染人肝癌细胞中的应用效果。方法培养人肝癌细胞Huh7．5-CD81并分为A、B组及对照组。 A组采用电转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；B组采用脂质体转染质粒pHebei（E1E2）／JFH1来源的HCV RNA；对照组采用脂质体转染复制缺陷质粒pJFH1／GND转录获得的HCV RNA。光学显微镜下观察各组转染后细胞形态，采用免疫荧光法（ IFA）检测三组转染效率，real-time PCR法检测三组细胞培养液上清中的HCV RNA，采用TCID50法检测A、B组细胞培养液上清中的丙型肝炎病毒（HCVcc）感染滴度。结果 A组转染使用细胞数为1×106，转染后第2天细胞损伤过半，边缘毛糙；B组转染使用细胞数为2×105，转染后第2天细胞基本无损伤。 A组转染效率为9．98％±0．83％，B组转染效率为2．58％±0．39％，两组转染效率相比，P＜0．01；对照组未检出荧光阳性细胞。 A、B组转染后细胞培养液上清中HCV RNA拷贝数均呈现先下降后升高的趋势，终稳定于106 copies／mL。 A组转染后21 d、B组转染后31 d方能检测到HCV感染滴度，A、B组收获HCV高感染滴度均为104 ffu／mL。结论脂质体转染和电转染两种方法均可建立嵌合HCV的人肝癌细胞培养体系，脂质体转染法对细胞的损伤较小，电转染法转染效率较高、收获HCVcc的时间较短，但两种方法收获的HCVcc感染滴度无明显差异。
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胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞与胰腺癌-树突融合细胞激发特异性细胞毒T淋巴细胞能力的比较研究
目的 比较人胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA电转染树突细胞(Dendritic Cell,DC)与DC-MiaPaCa-2融合细胞体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞(Cytotoxic T Lymphocyte,CTL)能力的差异.方法 自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC.使用电穿孔法将MiaPaCa-2细胞总RNA转染DC,使用细胞融合方法将胰腺癌MiaPaCa-2细胞抗原负载DC,以未负载抗原的DC为对照.使用流式细胞术(FCM)检测PE-MUC/FITC-CD86抗体双标细胞评估融合效率;四甲基偶氮唑盐(MTT)检测转染各组DC存活率;混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力;ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL因子释放量.结果 采用PEG-DMSO诱导的DC与MiaPaCa-2的融合细胞同时表达DC表型和MUC1分子,CD86与MUC1双阳性表达率为(42.3±7.30)％;融合细胞组DC存活率呈时间依赖性下降,转染后96h的存活率降低至62.81％,而MiaPaCa-2总RNA转染组DC细胞存活率稳定在85％左右,两组间差异有统计学意义(P＜0.05);转染MiaPaCa-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数(DC∶T=1∶10)为8432±611.25,显著高于DC-MiaPaCa-2融合细胞(DC∶T=1∶10)5672±107.51 (P＜ 0.05);且MiaPaCa-2总RNA转染DC激发特异性CTL分泌IL-12p70、IL-10和IFN-γ细胞水平亦显著异于DC-MiaPaCa-2融合细胞(P＜0.05).结论 胰腺癌细胞总RNA转染DC较胰腺癌-树突融合细胞有更强的体外抗原特异性CTL激发能力.
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胰腺癌细胞总RNA转染树突细胞诱导特异性CTL能力的体外研究
目的：观察人胰腺癌MiaPaCa-2细胞总RNA电转染树突细胞（Dendritic Cell，DC）体外激发抗原特异性细胞毒T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocyte, CTL）的能力。方法自6例胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DC。使用电穿孔法将MiaPaCa-2细胞总RNA体外转录和PCR扩增的MUC1 mRNA转染DC，以未负载抗原的DC为对照。采用实时定量PCR技术检测各组DC中MUC1表达。四甲基偶氮唑盐（MTT）检测转染各组DC存活率变化；混合细胞培养法评价各组DC体外刺激自体T淋巴细胞增殖能力；ELISA法检测各组DC体外激发抗原特异性CTL细胞因子释放量。结果 MiaPaCa-2总RNA与MUC1 mRNA分别转染后48 h DC中目标抗原的相对表达量分别为37.24±3.17和34.53±2.02，两者比较无显著差异（P>0.05）。电转染后96 h MiaPaCa-2总RNA转染组DC存活率降至60.81%，低于MUC1 mRNA单转染时DC的存活率（80%左右）（P<0.05）。转染MiaPaCa-2总RNA DC刺激自体T细胞增殖指数为8432±611.25，显著高于MUC1单独转染组3664±305.17（P<0.05）；且转染MiaPaCa-2总RNA DC激发特异性 CTL分泌IL-2、IL-10、Granzyme B、IFN-γ水平亦显著高于MUC1 mRNA单独转染组（P<0.05）。结论胰腺癌肿瘤细胞总RNA转染的DC较单一胰腺癌相关抗原负载DC有更强的体外抗原特异性CTL激发能力。
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双胰腺癌相关抗原RNA转染树突细胞诱导特异性抗癌免疫反应的实验研究
目的：研究人胰腺癌MUC4与Survivin mRNA联合转染树突细胞（DC）诱导的特异性抗肿瘤免疫反应，为构建负载多抗原表位DC疫苗治疗胰腺癌提供实验依据。方法自胰腺癌患者外周血单核细胞中分离、培养DCs。使用体外转录和胰腺癌PCR技术扩增MUC4和Survivin mRNA后用电穿孔法将其联合转染DC。采用Western blot技术检测DCs中MUC4和Survivin的表达。用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测转染前后DCs存活率变化；使用IFN-γ酶联免疫法检测MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后DC诱导的细胞毒性T淋巴细胞（CTL）的活化反应。采用51Cr标准细胞毒实验检测转染MUC4和Survivin mRNA后DCs诱导的特异性CTL对体外胰腺癌细胞的杀伤作用。结果 MUC4与Survivin mRNA联合转染后72 h DCs中两者的相对表达量低于其分别转染。顺序转染后96 h DCs存活率降至50.2%，低于MUC4 mRNA与Survivin mRNA分别转染时DC 80%的存活率（P<0.05）。MUC4和Survivin mRNA联合转染DC诱导的特异性CTL 24 h IFN-γ释放量达（33.84±3.51）U/mL，高于MUC4与Survivin mRNA分别转染DC诱导的CTL IFN-γ释放水平[（21.87±4.12）U/mL和（16.61±2.09）U/mL，P<0.05]。 DCs经MUC4 mRNA与Survivin mRNA联合转染后，可有效诱导HLA-A2+/MUC4+/Survivin+特异性CTL免疫反应，对体外培养的胰腺癌细胞具有显著的杀伤作用。结论 MUC4与Sur-vivin mRNA联合转染的DCs可较单胰腺癌相关抗原负载DCs诱导出更加显著的特异性CTL抗肿瘤免疫。amount of (21.87±4.12)U/ml by MUC4 or (16.61±2.09)U/ml by Survivin mRNA individually (P<0.05). DCs co-transfection with MUC4 and Survivin mRNA could effectively induce HLA-A2+/MUC4+/Survivin+specific CTL immune responses against pancreatic cancer cells in vitro. Conclusion The induction of CTLs by DCs co-transfected with human pancreatic cancer MUC4 and Survivin mRNA could produce more powerful specific anti-tumor immunity than single antigen loaded DCs.
