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乙型肝炎病毒X蛋白激活基因1的克隆化与序列分析
目的:利用分子生物学技术,研究乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)的反式激活作用,克隆HBxAg反式激活作用的靶基因,为进一步探索HBxAg的反式激活作用,以及反式激活作用的靶基因,阐明HBV感染引起慢性肝炎、肝细胞癌(HCC)发生发展的分子生物学机制,为探索新型预防和治疗技术、寻求新型途径奠定理论基础.方法:利用聚合酶链反应(PCR)技术,扩增HBxAg的编码基因,构建表达载体pcDNA3.1(-)-X,转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,与转染空白载体的HepG2细胞对照组分别提取总mRNA,并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于获得的差异表达基因片段序列的同源性基因进行搜索,确认为与已知的功能基因无同源性之后,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,完成新基因序列的确定.然后自HepG2细胞提取总mRNA,应用生物信息学技术确定的新基因的序列设计特异性引物,进行逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术的扩增,获得阳性克隆之后,进行鉴定并对克隆的基因及其编码产物的序列进行分析.结果:PCR技术扩增获得的HBxAg基因序列,经过限制性酶切鉴定和序列测定证实无误.转染HepG2细胞并提取足量的mRNA,利用SSH技术进行分析,获得的基因片段序列分析结果表明,其中之一为新型基因片段序列,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性.通过对EST数据库中注册的基因片段序列同源性的搜索和比对,电子拼接成功,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总mRNA,以RT-PCR技术,扩增获得该新基因的全基因序列,并测序证实,命名为XTP1,在GenBank中注册,注册号为AF488828.结论:利用分子生物学技术与生物信息学技术相结合,发现并鉴定、克隆了HBxAg的反式激活作用的新基因XTP1,并为进一步研究HBxAg的反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP5的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白5A(HCV NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为1 191个核苷酸(nt),编码产物由396个氨基酸残基(aa)组成.命名为NS5ATP5,在GenBank中注册,注册号为AF529366.结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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乙型肝炎病毒全S蛋白反式激活蛋白1基因的克隆化
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学(bioinformatics)技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)全S反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关疾病的发病机制.方法:以HBV全S蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-全S转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA逆转录为cDNA,经RssI酶切后将实验组cDNA分成2组,分别与2种不同的接头衔接,与对照组cDNA进行二次杂交和二次PCR.并结合生物信息学技术,克隆HBV全S反式激活作用的新型靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段.成功克隆出他的全长序列并测序证实,其可以被全S蛋白反式激活,故命名为全S反式激活蛋白1(CSTP1),已在GenBank中注册,注册号:AY553877.CSTP1基因的编码序列全长为945个核苷酸(nt),编码产物由315个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBV全S蛋白具有反式激活蛋白l基因克隆成功.HBV全S反式激活新靶基因的发现,为进一步研究HBV全S的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因NS5ATP7的克隆
目的:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及生物信息学技术筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白5A(NS5A)反式激活新型靶基因.方法:以HCV NS5A表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,确定新型基因序列.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP7,在GenBank中注册,注册号为AF529368.结果:NS5ATP5基因的编码序列全长为894个核苷酸(nt),编码产物由297个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5A反式激活新型靶基因NS5ATP5的筛选与克隆,为进一步研究HCV NS5A反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白反式激活基因TAHCCP2的克隆
目的:筛选与克隆HCV核心蛋白反式激活新型靶基因.方法:以HCV核心蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-core转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-core的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实.结果:新基因命名为TAHCCP2,编码序列全长为429个核苷酸(nt),编码产物由142个氨基酸残基(aa)组成,测序证实TAHCCP2克隆正确.在GenBank中注册,注册号为AY039043.结论:筛选与克隆HCV核心蛋白反式激活新型靶基因TAHCCP2,为进一步研究HCV核心蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因6的克隆和鉴定
目的:乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)是一种具有反式激活作用的病毒蛋白质.为了探索HBxAg蛋白反式激活作用的新的靶基因,利用抑制性消减杂交(SSH)技术对于表达和不表达HBxAg蛋白的HepG2细胞进行研究,以期发现HBxAg蛋白反式激活作用的新靶点,为阐明HBxAg蛋白的反式激活作用分子生物学机制,以及HBV相关的肝细胞癌(HCC)形成的分子生物学机制开辟新的研究方向.方法:以HBxAg表达质粒pcDNA3.1(-)-HBxAg转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交(SSH)分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,进行电子拼接,根据基因起始密码子的Kozak规则和终止密码子下游保守的多聚腺苷酸信号序列,克隆、鉴定新型基因.结果:在16种HBxAg蛋白上调的靶基因中,其中包括未知功能基因,利用生物信息学技术,获得HBxAg蛋白反式激活作用的新型靶基因,开放读码框架(ORF)长度为237个核苷酸(nt),编码产物由78个氨基酸残基(aa)组成,命名为XTP6,在GenBank中注册,注册号为AF490255.结论:HBxAg蛋白是一种具有反式激活作用的蛋白,应用抑制性消减杂交技术成功筛选与克隆HBxAg蛋白反式激活新型靶基因XTP6,为进一步阐明HBxAg蛋白反式调节作用及其在HBV感染中的分子生物学机制提供理论依据和研究方法.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1.NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCVNS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆
目的:为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制,筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因.方法:以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,确定新型基因序列并命名为XTP5.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列.结果:XTP5基因的编码基因序列全长为1527个核苷酸(nt),编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因XTP12的克隆化
目的:应用基因表达谱芯片技术及生物信息学技术筛选并克隆乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白反式激活新型靶基因,进一步阐明HBV感染相关性疾病的发病机制.方法:以HBV X蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取总RNA进行逆转录,对产物行基因表达谱芯片分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,克隆HBV X反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,因其可以被X蛋白反式激活,故命名为X蛋白反式激活蛋白12(XTP12),已在GenBank中注册,注册号:AY598792.PS2TP1基因的编码序列全长为731个核苷酸(nt),编码产物由230个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBVX反式激活新靶基因被成功克隆,为进一步研究HBV X蛋白的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定基础.
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人类乳头瘤病毒的实验诊断
人类乳头瘤病毒属乳多空病毒科乳头瘤病毒属,是小分子双链DNA病毒,据基因片段序列的多态性分型,目前已确定100余型[1].HPV亚临床感染和潜伏状态感染是尖锐湿疣感染状态的14倍,仅靠临床症状判断,则低估了HPV感染的严重性.随着核酸杂交技术和核酸扩增技术的发展,HPV的高感染率业已逐渐被人们认识.