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人骨髓来源多能成体祖细胞ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02体外共培养向肝样细胞的分化
目的:探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性.方法:(1)间接共培养:将第4代ZHJ-MAPCs和人肝细胞系L02仅培养液相通行间接共培养.分别于培养第1、3、5、7天应用免疫细胞化学法鉴定ZHJ-MAPCs的ALB、AFP、CK-18、CK-19等肝细胞特征性表型表达情况,并设阳性对照和阴性对照,计数阳性细胞比率;(2)直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的第4代ZHJ-MAPCs与L02(密度均为1×107/L)按照各50%比例混合行直接共培养.5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况.同样设阳性对照和阴性对照.结果:(1)间接共培养:AFP在ZHJ-MAPCs间接共培养第1天即表现为强阳性,随后表达逐渐减弱.ALB在共培养第1天有可疑阳性,第3天出现较强的阳性,第5天达到高峰.CK-18在培养第1、3天检测均为阴性,至第5天开始出现阳性,第7天表达较前增强.CK-19在各时间点均为阴性着色.(2)直接共培养:胞质内呈黄色荧光ALB和CK18的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs在共培养5 d时出现较多,而AFP阳性表达则仅出现在极个别细胞,该结果与阳性对照细胞荧光表达类似.结论:人骨髓来源的ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行间接或直接共培养均能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化,且直接共培养有提前趋势.
关键词： 人骨髓来源多能成体祖细胞 肝细胞 直接共培养 间接共培养 -
大鼠颌骨与胫骨骨髓基质细胞间接共培养后生物学差异的比较
目的 SD大鼠颌骨骨髓基质细胞(M-BMSCs)与胫骨骨髓基质细胞(T-BMSCs)体外间接共培养后,检测两者生物学特性和相关基因表达的变化.方法 应用全骨髓贴壁法,分离和培养M-BMSCs和T-BMSCs.取第三代细胞用Transwell小室间接共培养后,做以下检测.①MTT检测细胞增殖能力差异;②ALP活性、ALP染色、免疫荧光染色检测细胞成骨活性的差异;③荧光定量PCR检测Wnt1、Wnt5a、Hoxa1 1、Runx2、Ocn、Col I的表达差异和成骨诱导后的表达变化.结果 ①全骨髓贴壁法能分离和培养M-BMSCs和T-BMSCs;②间接共培养后,M-BMSCs和T-BMSCs增殖活力减弱;③共培养条件提高了T-BMSCs和抑制M-BMSCs早期表达ALP的能力;④间接共培养后,M-BMSCs和T-BMSCs中Wnt1、Wnt5a、Hoxa 11、Runx2、Ocn、Col I基因表达出现变化.结论 M-BMSCs和T-BMSCs间接共培养后,两者的生物学特点的改变和相关基因表达改变.
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与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞弹性蛋白、LOX及Fibulin -5mRNA表达的影响
目的:研究与盆底韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)分化的影响,探索在体外条件下诱导BMSCs向韧带成纤维细胞分化微环境的创建并检测诱导分化细胞内弹性蛋白、LOX、Fibulin-5的表达.方法:选择7天SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞并对其进行鉴定；取大鼠盆底韧带组织,自行分离传代,获得大鼠盆底韧带成纤维细胞；取纯化的第四代盆底韧带成纤维细胞与纯化培养后的第四代骨髓间充质干细胞间接共培养；实时定量RT-PCR检测弹性蛋白、LOX及Fibulin-5在不同共培养天数BMSCs中mRNA的表达情况.结果:与相应天数阴性对照组相比,3天共培养组弹性蛋白、LOX、Fbulin-5 mRNA的表达量增加,但均无显著变化(P＞0.05),6、12天共培养组mRNA的表达量均显著增高(P＜0.05)；与3天对照组相比,6天对照组和12天对照组的表达量均无显著变化(P＞0.05)；与3天共培养组相比,6天共培养组的表达量增高,但差异无统计学意义(P＞0.05),12天共培养组的表达量均有显著增高(P＜0.05).结论:与盆底韧带成纤维细胞间接共培养可以促进BMSCs弹性蛋白、LOX、Fbulin-5mRNA的表达,这一结果为BMSCs作为韧带组织工程的种子细胞在体外诱导分化条件的探索提供了一条新的研究思路.
关键词： 骨髓间充质干细胞 间接共培养 弹性蛋白 赖氨酰氧化酶 Fibulin -5 -
Emdogain对共培养成骨样细胞及内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响
目的:评价emdogain对直接与间接共培养条件下成骨样细胞和内皮细胞成骨及成血管基因表达的影响以及其间的相关性.方法:将人脐静脉内皮细胞(HUVEC)和成骨样细胞(MG63)按2∶1比例于12孔板内进行直接及间接共培养,并使用不同浓度(0、0.1、1、10、50上g/mL)的emdogain共培养细胞72 h.采用细胞计数仪结合流式细胞仪评价细胞增殖情况,并通过荧光激活流式细胞分选技术分选共培养细胞.对分选后的成骨样细胞及内皮细胞采用实时荧光定量PCR分别检测成骨相关基因碱性磷酸酶(ALP)、Ⅰ型胶原蛋白(Col-1)及成血管相关基因血管内皮细胞生长因子(VEGF)、VEGF酪氨酸激酶受体1(Flt-1)、VEGF酪氨酸激酶受体2(KDR)、von Willebrand因子(vWF)、内皮细胞C蛋白受体(EPCR)、E选择素(E-Selectin)、促血管生成素2(Ang-2)的表达水平.采用SPSS24.0软件包对数据进行统计学处理.结果:在直接与间接共培养条件下,Emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖的作用具有浓度依赖性.随着emdogain浓度增加,细胞增殖率逐渐下降.50 μg/mL浓度的emdogain对MG63及HUVEC细胞增殖抑制作用为明显.随着emdogain浓度增加,MG63表面ALP和Col-1表达水平逐渐增加;50 μg/mL浓度条件下,表达水平高且与其他组基因表达水平差异显著(P＜0.01).同一emdogain浓度条件下,直接共培养MG63表面ALP及Col-1表达水平均显著高于间接共培养(P＜0.01).除10 μg/mL组外,直接共培养条件下,VEGF表达水平均显著高于间接共培养(P＜0.01).50 μ,g/mL组直接共培养的HUVEC表面Flt-1、KDR、vWF、E-selectin基因表达水平显著高于间接共培养及直接共培养的其他各组(P＜0.01).间接共培养条件下,HUVEC表面EPCR及Ang-2基因表达水平显著高于直接共培养(P＜0.05).结论:Emdogain对共培养MG63和HUVEC增殖的作用具有浓度依赖性,50 μg/mL可能是emdogain作用的关键浓度.在直接共培养条件下,50 μg/mL emdogain抑制MG63及HUVEC细胞增殖,但能同时促进MG63及HUVEC细胞相关基因表达;且该条件下emdogain的作用显著强于其他实验条件,细胞间直接交联可能在其中发挥重要作用.
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人脱落乳牙牙髓干细胞促进破骨细胞形成的体外实验研究
目的:通过间接共培养的方法初步探讨人脱落乳牙牙髓干细胞(stem cells from human exfoliated decidu-ous teeth,SHED)在体外对破骨前体细胞分化的影响.方法:建立SHED与破骨前体细胞(外周血单个核细胞,periph-eral blood mononuclear cells,PBMCs)的间接共培养模型,利用TRAP染色观察PBMCs向破骨细胞样细胞分化后的细胞数目与形态,利用qPCR技术和Western Blot技术检测破骨相关基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6的表达,以评估PBMCs向破骨细胞样细胞分化的情况.结果:与对照组相比,SHED与PBMCs间接共培养模型中,TRAP染色阳性、具有多个核的破骨细胞样细胞数量显著增多,破骨相关基因TRAP、CTSK、c-Fos、TRAF6在PBMCs中的表达水平显著上调.结论:SHED能够以细胞非接触的方式促进破骨前体细胞向破骨细胞样细胞分化.
关键词： 人脱落乳牙牙髓干细胞 外周血单个核细胞 间接共培养 破骨细胞分化 -
与机械牵张盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞成肌分化抗原和结蛋白表达的影响
目的 研究与机械牵张的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)成肌分化的影响;探索在体外条件下诱导BMSCs向肌细胞分化的微环境的创建以及成肌分化抗原(myogenic differentiation antigen,MyoD)和结蛋白(des minfilament,Desmin)蛋白的表达.方法 选择7 d龄SD大鼠,利用密度梯度离心法体外分离纯化大鼠BMSCs.取大鼠盆底肛提肌组织,自行分离传代,获得大鼠盆底肛提肌卫星细胞.对第3代盆底肛提肌卫星细胞施以10 %形变,1 Hz,12 h的周期性单向机械牵张刺激,机械牵张后的盆底肛提肌卫星细胞与纯化培养后的第4代BMSCs间接共培养6 d.采用实时定量RT-PCR方法检测共培养后BMSCs中MyoD和Desmin mRNA的表达情况;Western-blot法检测MyoD和Desmin的蛋白含量.结果 与对照组相比,共培养组和机械牵张共培养组BMSCs 的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达水平均有显著增高(P<0.05);与共培养组相比,机械牵张共培养组BMSCs的MyoD和Desmin mRNA和蛋白的表达量也有显著增高(P<0.05).结论 与机械牵张刺激的盆底肛提肌卫星细胞间接共培养可以促进BMSCs合成MyoD和Desmin,诱导BMSCs向肌细胞分化.
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与韧带成纤维细胞间接共培养对大鼠骨髓间充质干细胞胶原蛋白和韧粘素-C表达的影响
骨髓间充质干细胞(BMSCs)可分化成多种细胞.已有研究表明,局部微环境影响细胞的生长、分化等功能,不同的细胞共培养可为细胞提供特定的环境.因此,本实验将大鼠BMSCs与大鼠韧带成纤维细胞间接共培养不同时间段后,检测其I型、III型胶原和韧粘素-C的mRNA表达以及I型、III型胶原的蛋白合成量.结果显示,体外培养6 d,间接共培养组BMSCsI型胶原mRNA的表达量(3.9±0.2)是对照组(1.9±0.3)的2.0倍;间接共培养组BMSCsIII型胶原的表达量(1.9±0.2)是对照组(0.8±0.1)的2.2倍,而韧粘素-C的mRNA表达量两组间无明显差异.体外培养12 d,间接共培养组BMSCs的I型和III型胶原mRNA表达量继续升高,它们的蛋白含量分别从对照组的12.4±0.8 ng/μg和5.0±0.4 ng/μg,增加到13.6±1.3 ng/μg和5.9±0.5 ng/μg;韧粘素-C的mRNA表达量(0.14±0.02)为对照组(0.07±0.02)的2.0倍.结果提示与韧带成纤维细胞间接共培养,可以促进BMSCsI型、III型胶原蛋白和韧粘素-C的合成.
关键词： 大鼠骨髓间充质干细胞 间接共培养 胶原蛋白 韧粘素-C -
兔骨膜成骨细胞与肾血管内皮细胞间接共培养的体外实验研究
目的探讨兔骨膜成骨细胞(RPOB)和肾血管内皮细胞(RRVEC)不同比例下间接共培养对成骨细胞增殖及功能的影响,优选细胞间接共培养的适宜比例. 方法取RPOB和RRVEC,采用细胞嵌盒培养系统,对照组、试验1、2、3组分别以RPOB和RRVEC按1∶0、2∶1、1∶1和1∶2间接共培养4天.通过细胞计数、碱性磷酸酶(ALP)活性测定及3H-脯氨酸掺入试验观察RPOB和RRVCE增殖分化能力及功能状态.结果试验1组RPOB较对照组、试验2、3组增殖活跃(P＜0.05),且3H-脯氨酸掺入较高(P＜0.05);试验1组ALP活性较对照组和试验3组高(P＜0.05),但与试验2组无显著差异(P＞0.05). 结论 RPOB和RRVEC以2∶1进行间接共培养时RPOB增殖能力强、功能活跃,适宜进一步组织工程研究.
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人髌下脂肪垫干细胞与骨关节炎软骨细胞间接共培养可促进其向软骨细胞分化
目的 将人髌下脂肪垫干细胞(IPFPSC)及骨关节炎软骨细胞(OAC)进行间接共培养,促进OAC软骨表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化.方法 体外分离、培养人IPFPSC及OAC,分为单独IPFPSC组、单独OAC组及IPFPSC和OAC间接共培养组,体外成软骨诱导21 d后,通过HE染色、Alcian蓝染色、免疫荧光细胞化学染色检测细胞1型胶原蛋白(Col1)、Col2、Col10、聚集蛋白聚糖(aggrecan)及SOX-9的表达情况.结果 共培养组OAC聚集成微球,IPFPSC呈椭圆形;单独组OAC聚集分布,排列松散,单独组IPFPSC呈长梭形.HE染色显示共培养组OAC聚集成团,核染色深,IPFPSC呈椭圆形,胞质丰富,呈旋涡状生长;单独组OAC聚集分布,核染色浅;单独组IPFPSC呈长梭形,核染色浅.Alcian蓝染色显示共培养组OAC及IPFPSC蛋白多糖分泌多,单独OAC及单独IPFPSC组分泌少.免疫荧光细胞化学染色显示共培养组IPFPSC及OAC中Col2、aggrecan及SOX-9表达较强,Col1与Col10表达较弱;而单独培养的IPFPSC及OAC组则相反.结论 IPFPSC和OAC间接共培养可以促进OAC软骨细胞表型的恢复及诱导IPFPSC向软骨细胞分化.
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苯妥英钠对大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化的影响
目的：研究苯妥英钠（PHT）对大鼠骨髓间充质干细胞（rBMSCs）向血管内皮细胞（rVECs）分化的影响。方法：建立rBMSCs 与 rVECs 共培养组及 rBMSCs 单独培养组，各组分别添加不同浓度的 PHT（0、20、40μg／ml），培养14 d 后 real-time PCR 检测各组细胞中 ICAM-1、VCAM-1、KDR 和 RUNX2基因的 mRNA 表达水平。结果：添加 PHT 后，各组细胞中 ICAM-1、KDR 和 RUNX2基因的 mRNA 表达均上调。添加相同浓度 PHT 时，共培养组较单独培养组中 rBMSCs 的 ICAM-1、KDR 和RUNX2基因的 mRNA 表达量增高，而 VCAM-1基因的 mRNA 表达量降低。结论：PHT 可能促进大鼠骨髓间充质干细胞向血管内皮细胞分化。
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苯妥英钠对大鼠骨髓间充质干细胞与血管内皮细胞 VEGF 和 SCF 分泌的影响
目的：研究苯妥英钠(PHT)对大鼠骨髓间充质干细胞(rBMSCs)和血管内皮细胞(rVECs)间接共培养体系中血管内皮细胞生长因子(VEGF)和干细胞因子(SCF)分泌的影响。方法分别建立 rBMSCs、rVECs 单独培养组及共培养组,各组添加不同质量浓度的 PHT(0、20、40μg/mL)。在培养第2、4、6天时,用双抗体夹心 ABC-ELISA 法检测培养上清中 VEGF 和 SCF 的含量。结果① VEGF：培养第二天时,在相同 PHT 作用下,共培养组 VEGF 含量高于rBMSCs 单独培养组(P <0.05)和 rVECs 单独培养组(P <0.001)；共培养组随着培养时间的延长和 PHT 浓度增大VEGF 含量增加(P <0.001,P <0.05)。②SCF：共培养组 SCF 含量高于相同 PHT 浓度下的单独培养组；在共培养组中,当 PHT 为20μg/mL 时,随着培养时间延长 SCF 含量增加；当 PHT 为40μg/mL 时,随着培养时间延长 SCF 含量减少,但差异无统计学意义(P >0.05)。结论PHT 可促进 rBMSCs 与 rVECs 共培养体系中 VEGF 的分泌,可能降低 SCF 的分泌。
