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郑州与北京地区HCV5′-非编码区酶切基因分型对比研究
目的探讨郑州与北京地区丙型肝炎病毒(HCV)基因型分布情况.方法分别对郑州地区的90例抗-HCV阳性献血员及北京地区269例肝炎患者血清采用逆转录套式聚合酶链反应(RT-nested-PCR)进行HCV RNA检测,其中郑州地区80例呈HCV RNA阳性,北京地区56例呈HCV RNA阳性,并对两地区病例的阳性PCR产物进行5′-非编码区(5′-NCR)酶切基因分型.结果郑州地区HCV Ⅱ型感染55例(68.8%),HCV Ⅲ型感染21例(26.2%),HCV Ⅱ/Ⅲ型混合感染4例(5.0%).北京地区HCV Ⅱ型感染49例(87.5%),HCV Ⅲ型感染7例(12.5%),无HCV Ⅱ/Ⅲ型混合感染.结论 HCV Ⅱ型感染是郑州地区的优势株,其次是HCV Ⅲ型,Ⅱ/Ⅲ型混合感染较少见.而北京地区主要以HCV Ⅱ型为主,HCV Ⅲ型感染少见.
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丙型肝炎病毒非结构区NS5A研究进展
0引言目前全球各国丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)感染率为0.5%～4%,平均为3%左右[1-12],其中20%左右是急性肝炎,70%～80%转变成慢性肝炎,而慢性丙型肝炎一般经过20 a～30 a发展为肝硬变或肝细胞癌(HCC),HCV相关性终末期肝病已成为欧美一些国家进行肝移植的主要适应证[12-28],危害极大.HCV是正单股RNA病毒,包括5′非编码区(5′non-coderegion,5′-NCR),一个长约9400bp的单一开放阅读框(openreading frame,ORF)和3′非编码区(3′non-encode region,3′-NCR),5′-NCR其间有内源性核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)其中OFR包括结构区(structural region)和非结构区(nonstructural region),在结构区中有C,E1,E2,P7区,在非结构区中有NS2,NS3,NS4A,NS5A和NS5B区等[24,29-33].近年来,有关HCV NS5A区的结构与功能倍受关注,现就HCV NS5A作一综述.
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酵母双杂交技术筛选克隆HCV核心蛋白结合蛋白基因1
目的克隆与丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白结合的肝细胞中的未知蛋白基因方法应用酵母双杂交系统3构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AH109后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个阳性克隆,对既能在4缺营养缺陷培养基上生长(SD/-Trp-Leu-Ade-His)又能在涂有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养平皿上长出蓝色菌落,提取此酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后进行测序,进行生物信息学分析.将HCV核心蛋白基因分为大、中、小三段,与所克隆的未知功能基因回交,以证实其相互作用的部位.结果分析的结果显示,其中1号克隆的测序结果与GenBank中的1个未知功能序列有99%的同源性,初步证明了此基因与HCV核心蛋白有结合活性(GenBank号:AY032593).HCV核心蛋白的全长、2/3,1/3三段,回交显示三段均能在酵母中与此未知基因具有结合作用.结论 HCV核心蛋白结合蛋白肝细胞基因克隆成功,核心蛋白与此未知基因的作用部位应是氨基端.此项研究结果,为以后研究此基因在HCV致病机制以及在肝细胞中的生理功能提供了线索.
关键词： C型肝炎样病毒属/遗传学 病毒蛋白质类/遗传学 基因 病毒 克隆 分子 遗传学技术 -
静脉药瘾者丙型肝炎病毒感染的分子流行病学
目的调查重庆市静脉内药瘾者丙型肝炎病毒(HCV)不同基因型感染状况.方法静脉内药瘾者284例,其中男191例,女93例,年龄21岁～36岁,用酶标记免疫(ELISA)法检测HCV感染情况,用逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)与限制性长度多态性(RFLP)分型检测HCVRNA,并观察血清ALT,AST水平.结果重庆市静脉内药瘾者中,anti-HCV IgG阳性率为40.5%;HCVRNA阳性率为34.5%,其中HCV lb型,2a型及1b/2a混合型感染率分别为33.7%,46.9%及19.4%.HCV基因型与血清ALT,AST水平变化无明显关系.结论重庆地区静脉毒瘾者HCV感染以2a型为主(46.9%),其次为1b型(33.7%),1b/2a混合型亦不少见(19.4%).HCV基因型与血清ALT和AST水平变化无明显关系.
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HCV C基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-C的构建、鉴定及表达
目的构建能表达HCV C基因的腺病毒表达载体的重组骨架质粒,为进一步包装能高效表达HCV C基因的腺病毒载体做准备.方法用分别含有BglⅡ及HindⅢ酶切位点的HCV C区基因上、下游引物,以含有HCV H株基因序列的质粒pBRTM/HCV1-3011为模板,通过PCR扩增获得HCV C区基因片段,基因片段回收后,以BglⅡ及HindⅢ双酶切,定向插入到腺病毒骨架质粒pAd.CMV-Link.1中CMV启动子下游BglⅡ与HindⅢ位点之间,获得重组表达质粒pAd.HCV-C.通过BglⅡ/HindⅢ双酶切、PCR及插入片段序列测定对质粒进行了鉴定.以抗HCV C单克隆抗体为一抗,利用间接免疫荧光法检测了pAd.HCV-C在人肝癌细胞7721中的瞬时表达.结果酶切、PCR及测序鉴定证实,pAd.HCV-C插入片段为HCV C区基因片段,免疫荧光法检测表明其可以在7721细胞中瞬时表达.结论构建的质粒pAd.HCV-C可以在7721细胞中瞬时表达HCV C区基因,为包装表达HCV C基因的腺病毒载体奠定了基础.
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建立转录丙型肝炎病毒结构区基因细胞模型的研究
目的:建立转录丙型肝炎病毒(HCV)结构区基因的细胞模型,为研究中药在体外对HCV结构区基因转录的抑制作用提供实验用细胞模型.方法:用脂质体将已构建好的含HCV结构区基因1.73kb的真核细胞表达载体pBK-CMV转入人HeLa细胞,用G418选择性培养基筛选出成功转染的HeLa细胞(HeLaD细胞),用Trizol提取HeLaD细胞的总RNA,通过特异性引物进行逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR),从mRNA水平来验证HeLaD细胞中HCV结构区基因的有效转录.结果:对从HeLaD细胞抽提的总RNA作RT-PCR,得到144bp的特异的扩增片段,证实HCV结构区基因在HeLaD细胞中有转录水平的表达.结论:重组质粒pBK-CMV能被成功地转染人HeLa细胞,且HCV的结构区基因能够有效地表达,成功建立了能转录HCV结构区基因的细胞模型-HeLaD.
关键词： C型肝炎样病毒属/遗传学 Hela细胞 遗传载体 转染 -
应用荧光定量PCR检测血清中HCV RNA
目的:探讨荧光定量PCR(FQ-PCR)法检测血清中丙型肝炎病毒(HCV)含量的敏感性、特异性.方法:采用FQ-PCR和逆转录巢式PCR同步检测76份HCV抗体阳性血清标本,并对两种方法的检测结果进行对照比较.结果:FQ-PCR定量HCV RNA拷贝数在102～106拷贝*μl-1,其中低于103拷贝*μl-1占20.93%,103～105拷贝*μl-1占60.47%,高于105拷贝*μl-1占18.60%.76份HCV抗体阳性血清中,巢式PCR检测阳性为45份,FQ-PCR检测阳性为43份,二者相对符合率为97.37%.结论:FQ-PCR检测HCV RNA与常规定性巢式PCR特异性、敏感性基本一致.
关键词： C型肝炎样病毒属/遗传学 RNA 病毒/分析 聚合酶链反应 荧光计 -
HCV、NS5A 区部分基因克隆和序列分析
目的研究输血后肝炎病人的基因型,探讨HCV抵抗IFN疗效的作用机制.方法以RT-PCR从慢性丙肝病人血清中扩增一段486 bp的cDNA片段作目的基因,插入PQE30的多克隆位点,构建重组质粒PQE30-NS5A-1U1D.结果应用限制酶酶切和测序分析,证实PQE30-NS5A-1U1D中克隆基因是HCVJ的NS5A部分序列,核苷酸和氨基酸序列同源性均在90%以上,包含有干扰素敏感决定区(ISDR).结论血清学抗体检测NS5A片段对HCV诊断有独特的应用价值,有助于抗病毒药物疗效的判定.
关键词： C型肝炎样病毒属/遗传学 序列分析
