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EB病毒VCA基因片段在毕赤酵母中的表达及临床应用
目的 探讨EB病毒(Epstein-Barr vires,EBV)壳抗原VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白在鼻咽癌血清学诊断中的应用.方法 以EBV DNA为模板,采用PCR法扩增目的 基因片段BALF4(S)和BFRF3,与毕赤酵母表达载体pPICZaA连接,转化酵母菌GS115,甲醇诱导重组蛋白表达.表达产物经SDS-PAGE、免疫印迹法鉴定后,纯化目的 蛋白作为包被抗原,制备ELISA试剂检测鼻咽癌患者和正常人群EBV-IgA抗体.结果 在毕赤酵母菌中成功高效地表达了分泌型的VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白,相对分子质量分别为37×10~3和18×10~3,免疫印迹证实目的 带均有免疫原性,目的 蛋白经纯化后作为包被抗原检测鼻咽癌患者和健康对照的敏感度和特异度分别为71.0%和91.8%(VCA-BFRF3)、88.7%和96.4%[VCA-BALF4(S)].结论 毕赤酵母系统高效分泌表达了VCA-BALF4(S)和VCA-BFRF3重组蛋白,对两种重组抗原在鼻咽癌血清筛选中的诊断价值进行了初步评估,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的pPICZa-BALF4(S)生产酵母工程菌株.
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EB病毒gp125蛋白的B细胞表位预测
目的 预测EB病毒gp125蛋白的B细胞表位.方法 基于EB病毒gp125蛋白的氨基酸序列,采用亲水性参数、可及性参数、极性参数和抗原性指数方案等,辅以对gp125蛋白的二级结构中的柔性区域的分析,预测gp125蛋白的B细胞表位.结果 有可能的B细胞表位位于gp125蛋白N端第403-416、565-574、578-584、618-630和832-843区段及其附近.结论 用多参数预测EB病毒gp125蛋白的B细胞表位,为制备具有高灵敏度和高特异性的鼻咽癌诊断试剂及研究抗肿瘤转移靶向治疗的分子免疫学奠定基础.
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EB病毒BALF4基因在大肠杆菌中的表达纯化与鉴定
目的 采用大肠杆菌表达EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)壳抗原BALF4(S)重组蛋白并探讨其在鼻咽癌血清学诊断中的应用.方法 以EBV DNA为模版,采用PCR法扩增目的基因片段BALF4(S),与原核表达载体PGEX-5X-1连接,构建PGEX-5X-BALF4(S)工程菌株,在大肠杆菌BL21 (DE3)中表达GST/BALF4 (S)重组融合蛋白.表达产物经SDS-PAGE、免疫印迹法鉴定后,纯化目的蛋白作为包被抗原,制备ELISA试剂检测鼻咽癌患者和正常人群BALF4(S)-IgA抗体.结果 在大肠杆菌中成功地表达了GST/BALF4 (S)重组融合蛋白,相对分子质量为63000,免疫印迹证实目的带有免疫原性,目的蛋白经纯化后作为包被抗原检测鼻咽癌患者和健康对照者的灵敏度和特异度分别为78％和90％.结论 本文采用大肠杆菌系统成功表达了GST/BALF4 (S)重组融合蛋白,对重组抗原在鼻咽癌血清筛选中的诊断价值进行了初步评估,获得了在鼻咽癌筛选中有一定应用价值的PGEX-5X-BALF4 (S)工程菌株.
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EB病毒LMP-1、BALF4及BARF1片段的B细胞表位预测
目的:预测EB病毒LMP-1、BALF4及BARF1片段的B细胞表位.方法:采用Protean软件分析EBV的LMP1、BALF4及BARF1三个氨基酸片段的亲水性、表面可能性、抗原指数及其二级结构中的柔性区域,并结合吴玉章的抗原指数预测法预测其B细胞表位.结果:B细胞表位可能位于LMP-1 N端第356-58,2-19,249-314区段,BARF1N端第8-11,18-25,41-49,203-211区段,BALF4N端第385-387,833-845,398-415,427-435,453-458,23-32,466-473,234-250,642-652区段；另外LMP-1第185-223、BARF1第265-272,132-135以及BALF4第827-832区段内或附近也可能存在B细胞表位.结论:用多参数同时预测LMP-1、BALF4及BARF1的B细胞表位,为制备高效的鼻咽癌血清学诊断试剂和表位疫苗奠定了理论基础.
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EB病毒壳抗原在大肠杆菌中的表达与应用
目的:获得足够的EB病毒壳抗原,建立ELISA方法用于鼻咽癌的诊断.方法:将BALF4基因克隆进入载体pUR291,在大肠杆菌中表达EB病毒壳抗原与β-半乳糖苷酶的融合蛋白,并通过DEAE-SepharoseFastFlow离子交换柱层析对融合蛋白进行纯化,将纯化的蛋白用于ELISA方法检测人血清中的IgG/VCA和IgA/VCA抗体,用带有pUR291质粒的宿主菌裂解液吸收待检血清中的抗β-半乳糖苷酶抗体.结果:ELISA方法与免疫荧光方法检测的结果呈正相关(r=0.6236,P<0.001;r=0.9225,P<0.001).免疫荧光方法检测为阳性的血清,ELISA检测均为阳性;IgG/VCA和IgA/VCA抗体的几何平均滴度(GMT)分别是免疫荧光方法的13倍和15倍.在40份免疫荧光检测IgA/VCA阴性的血清中,ELISA检测有3例阳性,表明ELISA方法比免疫荧光方法更敏感.结论:在原核系统中表达抗原,为ELISA方法在鼻咽癌的诊断和大规模血清学普查中的应用提供了一个有效手段.
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EB病毒BALF4基因的短肽合成及在鼻咽癌检测中的应用
目的：利用基因工程技术合成EB病毒抗原多肽gp125，并探讨其在鼻咽癌血清学诊断中的应用。方法：利用因特网服务器预测EB病毒gp125蛋白的B细胞抗原表位，同时合成短肽，包被聚丙乙烯板，制备ELISA试剂，检测鼻咽癌患者和正常人群 gp125-IgA 抗体，对 B 细胞抗原表位在鼻咽癌诊断中的价值进行评估。结果：共合成6条短肽，其中2条特异性不高，其他短肽序列鼻咽癌组阳性检出率均高于健康组（P ＜0．001）。结论：成功合成EB病毒BALF4基因短肽并筛选出特异性高、免疫原性强的表位，为表达具有更高特异性和灵敏性的gp125蛋白作准备。
