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小鼠galectin-9可通过分泌形式诱导Tim-3~-T细胞凋亡
目的 构建小鼠galectin-9重组腺病毒pAd-gal-9,探讨galectin-9的真核表达定位以及galectin-9诱导T细胞凋亡与Tim-3表达的关系.方法 常规分子克隆方法 结合LR反应构建腺病毒重组质粒pAd/CMV/V5-DEST-gal-9,以Pac I线性化后,用脂质体2000体外转染293A细胞,8 d后反复冻融细胞3次收集含病毒上清,并以此上清感染293A细胞大量扩增病毒pAd-gal-9.CsCI密度梯度离心法纯化病毒,96孔板法梯度感染293A细胞测定病毒滴度,然后感染CHO细胞,用免疫组化、Western blot和流式细胞仪分析galectin-9的表达水平和定位;以新鲜培养的上清或固相化的细胞分别与外周淋巴结细胞进行培养,AnnexinV/PI法检测T细胞凋亡情况,对比凋亡细胞比例与Tim-3~+ T细胞的比例.结果 重组腺病毒构建及表达成功,免疫组化表明galectin-9在CHO胞质表达;Westernblot证实galectin-9表达;流式分析表明胞内染色组galectin-9平均荧光强度显著高于表面染色组,病毒感染CHO表面染色组与空白对照组galectin-9平均荧光强度无明显区别;新鲜培养的上清可以明显诱导T细胞发生凋亡,显著高于Tim-3~+ T细胞的比例.结论 重组腺病毒pAd-gal-9构建成功,体外感染pad-gal-9的CHO分泌galectin-9诱导T细胞凋亡可以不依赖Tim-3的表达.
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一株Th2样T细胞杂交瘤表型及胞内细胞因子的检测
按照分泌细胞因子和介导免疫功能的不同,可将小鼠及人类的CD4+T细胞分为Th1和Th2两个亚群.本文应用膜表面和细胞内免疫荧光染色以及流式细胞仪分析,对一株人T细胞杂交瘤进行了检测,表明其是属于Th2样的T细胞杂交瘤.
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9.1C3胞内抗体基因的克隆及其对9.1C3分 子表达的抑制作用
[欧阳为明，金伯泉，夏海滨，刘 飞，李德敏，张建平. 中华微生物学和免疫学 杂志，2001;21(1):58-61] 目的 获得9.1C3胞内抗体基因的真核表达载体，观察胞内抗体对9.1C3分子表 达的抑制作 用，为进一步研究9.1C3分子对NK细胞功能的影响打下基础. 方法 设计引 物，以9.1C3 ScF v基因为模板进行PCR扩增，引入蛋白质内质网定位所需的信号肽、KDEL以及作为表达检测标 记的Etag序列. 回收纯化PCR产物，酶切后连接到pUC19载体上，并进行序列测定. 序列正确 后 切下胞内抗体基因片段，重组到真核表达载体pRc/CMV中，酶切鉴定后用DEAE-dextran方法 瞬时转染真核细胞COS7，用胞内染色和Westem blot 方法检测胞内抗体的表达. 接着用Lipofectamine把胞内抗体基因转入9.1C3阳性的Jurkat细 胞，用FCM观察胞内抗体对9.1C3分子表达的影响. 结果 DNA序列测定证明 ，通过PCR成功地 为9.1C3 ScFv引入了内质网定位所需的信号肽、KDEL及E-tag序列，成功地构建了胞内抗体 真核表达载体，通过胞内染色方法和Westem blot证明胞内抗体在COS7中得到表达. 转入Jur kat细胞后发现胞内抗体能下调9.1C3分子的表达水平. 结论 以9.1C3 ScF v基因为模板PCR扩增得到9.1C3胞内抗体基因，并构建了真核表达载体.(井晓梅)
