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胶质瘤miR-218与细胞周期蛋白依赖性激酶6表达的相互关系及其对肿瘤细胞增殖和凋亡的影响
目的 探讨胶质瘤细胞中miR-218及细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)表达变化的相互关系及其对肿瘤细胞增殖及凋亡的影响.方法 采用组织微阵列、锁定寡核苷酸探针原位杂交及免疫组织化学(ABC法)方法,检测60例不同级别胶质瘤组织标本及10例对照脑组织中miR-218、CDK6及Ki-67抗原的表达状况,并分析三者之间的相互关系;胶质母细胞瘤细胞系(U87MG)分别被转染阴性对照序列(对照组)及miR-218 mimics(mimics组),采用即时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)及免疫细胞化学方法 分别检测两组细胞中的miR-218水平及CDK6和Ki-67表达变化,用单细胞凝胶电泳检测凋亡细胞.结果 对照组、Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组miR-218阳性标记指数(LI,%)分别为22.45±0.59、4.00±1.07、1.87±1.06、0.94±0.78,四组间差异均有统计学意义(P<0.05);各组CDK6 LI分别为7.25±1.20、16.71±0.80、24.43±0.62、32.05±0.43,对照组与各胶质瘤组间及Ⅳ级组与Ⅰ～Ⅱ级组间差异有统计学意义(P<0.01);各组Ki-67阳性细胞密度分别为0.00±0.00、9.30±3.48、31.15±9.44、60.15±13.60[(±s)/0.05 mm2],各组间差异均有统计学意义(P<0.01);miR-218 LI与CDK6 LI及Ki-67阳性细胞密度间均呈显著性负相关(r=-0.480,-0.534,P<0.01),后两者间呈显著性正相关(r=0.530,P<0.01).mimics组的miR-218水平明显高于对照组,其CDK6及Ki-67 LI(14.74±1.19、30.88±3.31)均明显低于对照组(79.06±2.07、64.94±3.96,P<0.01),而凋亡指数(68.44±7.05)明显高于对照组(13.04±0.97),以上各指标两组间差异均有统计学意义(P<0.01).结论 miR-218表达水平是评价胶质瘤良恶性程度的重要参考指标;其表达异常减少可导致胶质瘤细胞CDK6表达及增殖活性增强;补充外源性miR-218可有效下调恶性胶质瘤细胞CDK6表达、抑制其增殖和促进其凋亡,故在恶性胶质瘤基因治疗中具有重要的潜在应用价值.
关键词： 神经胶质瘤 微RNAs 细胞周期蛋白依赖激酶6 细胞增殖 细胞凋亡 -
miR-497靶向CDK6抑制喉鳞状细胞癌生长的实验研究
目的 研究miR-497和细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase,CDK6)在喉鳞状细胞癌生长过程中的作用.方法 利用定量实时聚合酶链反应分析喉鳞状细胞癌及癌旁正常黏膜标本中CDK6 mRNA表达情况;评价CDK6mRNA的表达水平与喉鳞状细胞癌患者预后的关系;通过生物信息学预测miR-497的靶基因CDK6,并利用双荧光素酶报告基因验证;构建CDK6siRNA和质粒pcDNA3.1(+)CDK6,分别转染喉鳞状细胞癌细胞后,利用四甲基偶氮唑蓝法和克隆形成实验,观察喉鳞状细胞癌细胞生长的变化,并使用流式细胞术观察细胞周期的分布.统计学数据采用SPSS17.0进行分析.结果 CDK6在喉鳞状细胞癌中高表达(t=14.01,P=0.009),且CDK6高表达组患者的总生存率低于低表达组,差异有统计学意义(HR=3.236,P＜0.001);双荧光素酶报告基因显示,野生型CDK6荧光活性变化倍数与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.01).而突变型与对照组比较,差异无统计学意义(P＞0.05).在细胞系Hep-2和TU-212中,CDK6 siRNA组A490值Hep-2细胞为(0.42±0.14,(x)±s),TU-212细胞为(0.51±0.13),较对照组Hep-2细胞(0.98±0.16)和TU-212细胞(1.17±0.20)明显减低,细胞的生长受到抑制;Hep-2细胞的克隆为(55±4)个,TU-212细胞为(51±3)个,也明显低于对照组Hep-2的(108±6)个和TU-212的(105±7)个;细胞阻滞在G0/G1期,Hep-2细胞G0/G1期百分比为(65.20± 10.12)％,TU-212为(63.42±8.97)％,明显高于对照组Hep-2的(45.31±7.55)％和TU-212的(42.37±7.28)％,S期细胞明显减少,Hep-2细胞中S期细胞数百分比为(25.39±5.51)％,TU-212为(27.21±5.43)％,明显低于对照组Hep-2的(42.87±6.85)％和TU-212的(44.76±7.02)％;miR-497/CDK6组与miR-497组相比,细胞的生长、克隆形成能力部分得到恢复.以上相应各组比较,差异均有统计学意义(P值均＜0.05).结论 CDK6在喉鳞状细胞癌中表达升高,具有癌基因的作用,且CDK6高表达提示患者预后不良.miR-497通过靶向CDK6抑制了喉鳞状细胞癌的生长,具有抑癌基因的作用.
关键词： 喉肿瘤 癌 鳞状细胞 细胞周期蛋白依赖激酶6 -
人剪切修复基因XPD对人肝癌SMMC-7721细胞中Ets-1和Cdk6基因的调控作用
目的:观察野生型人剪切修复基因XPD转染入人肝癌细胞SMMC-7721后,细胞内Ets-1和Cdk6基因的表达变化及对SMMC-7721肝癌细胞增殖的影响.方法:将人工合成的pEGFP-N2-XPD重组质粒通过Lipofectamine 2000TM转染SMMC-7721细胞.设重组质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2-XPD (XPD)组、空载质粒转染细胞SMMC-7721-pEGFP-N2(N2)组、脂质体组、无转染空白对照组.分别用逆转录-聚合酶链反应(RTPCR)和蛋白印迹法(Western blot)检测细胞中XPD、Ets-1、Cdk6基因mRNA和蛋白质的表达量,并用流式细胞仪检测细胞周期变化,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT)检测各组细胞的增殖活力.结果:XPD组中的XPD的mRNA和蛋白质表达较其他3组明显增高(P＜ 0.001),而Ets-1、Cdk6 mRNA和蛋白质表达较其他3组明显减少(P＜ 0.001).转染pEGFP-N2-XPD重组质粒后细胞停滞在G1期,难于进入S期.转染了野生型XPD的SMMC-7721细胞增殖能力减弱.结论:XPD基因可能通过抑制Ets-1、Cdk6基因的表达影响肝癌细胞的生长.
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RNA干扰细胞周期蛋白依赖激酶6基因对尤文肉瘤细胞生物学行为的影响
背景与目的：细胞周期蛋白依赖激酶6(cyclin-dependent kinase 6，CDK6)是一类丝/苏氨酸蛋白激酶，有实验报道其在尤文肉瘤细胞中呈高表达，但在尤文肉瘤细胞中的生物学功能及相关机理仍不十分清楚。本研究旨在通过研究小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)沉默CDK6基因表达，探讨其对尤文肉瘤A673、SK-ES-1细胞生物学行为的影响。方法：将化学合成的CDK6-siRNA转染至A673及SK-ES-1细胞中，实时荧光定量PCR法检测转染前后细胞中CDK6 mRNA的表达；蛋白质印迹法(Western blot)检测转染前后细胞CDK6以及CDK6下游因子视网膜母细胞瘤基因(Rb)、磷酸化Rb(P-Rb)的蛋白表达；分别采用CCK-8法、流式细胞仪、Transwell肿瘤细胞迁移和侵袭实验检测细胞增殖、周期、凋亡、迁移以及侵袭能力的变化。结果：实时荧光定量PCR结果显示，CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6的表达(P<0.01)。抑制CDK6表达后细胞的增殖速度明显减缓，细胞周期分布发生改变，G0/G1期细胞的比例上升，而S期细胞的比例下降，细胞的早期凋亡率明显升高(P<0.01)。各组细胞的迁移能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(516.00±58.59)个、(534.00±124.77)个、(192.33±68.92)个，SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(371.33±29.67)个、(363.33±60.28)个、(200.00±20.00)个，差异有统计学意义(P<0.01)；各组细胞的侵袭能力：untreated组、si-con组及si-CDK6组A673细胞的穿膜细胞数分别为(251.00±42.93)个、(238.67±78.62)个、(94.67±23.03)个，SK-ES-1细胞的穿膜数分别为(310.00±35.36)个、(302.33±41.31)个、(105.00±54.08)个，差异有统计学意义(P<0.01)。Western blot检测结果显示，CDK6-siRNA能够明显降低细胞CDK6以及下游因子P-Rb的表达(P<0.01)，但细胞总Rb表达量无明显变化。结论：针对CDK6基因的特异性小RNA干扰片段能够下调CDK6基因及蛋白的表达，并抑制尤文肉瘤细胞增殖、侵袭和迁移，诱导其凋亡。
关键词： 尤文肉瘤 RNA干扰 细胞周期蛋白依赖激酶6 -
微小RNA let-7c通过靶定细胞周期蛋白依赖激酶6抑制肝癌细胞增殖
目的 观察微小RNA(miRNA,miR) let-7c对肝癌细胞增殖的影响并验证其靶基因.方法 实时定量聚合酶链反应(Real-time PCR)检测人肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721及人肝细胞L02中let-7c的表达.使用LipofectamineTM 2000脂质体将miRNA转染入HCCLM3细胞,设转染let-7c的细胞为let-7c组,转染阴性对照miRNA的细胞为对照组,空白组未进行转染,细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测let-7c对细胞增殖的影响,流式细胞术检验各组细胞周期的差异,Western blot检测转染后细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)的蛋白表达情况.将CDK6的3'端非编码区(3'-UTR)连接入pMIR-REPORT荧光素酶载体,建成荧光素酶报告基因.将miRNA、荧光素酶报告基因、海肾荧光素酶质粒共转染入293T细胞,检测转染后荧光素酶的活性,验证1et-7c对3'-UTR的结合作用.结果 肝癌细胞MHCC-97L、HepG2、HCCLM3、SMMC-7721中的let-7c表达量均低于L02,表达量分别为(3.22±0.08) ×10-4、(2.34±0.11)×10-4、(1.85 ±0.03) ×10-4、(3.03±0.11) ×10-4及(4.37 ±0.09)×10-4(P ＜0.05).let-7c组细胞在转染后48、72、96 h的吸光度值均低于对照组及空白组(P＜0.05),而对照组与空白组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后72 h,let-7c组细胞处于G1期的比例为(56.95 ±2.40)％,均高于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).转染后48 h,let-7c组CDK6蛋白的表达量均低于另外两组(P＜0.05),而另外两组比较差异无统计学意义(P＞0.05).双荧光素酶报告基因检测发现let-7c与对照miRNA比较,能抑制荧光素酶的活性(P＜0.05).结论 let-7c在肝癌细胞中的表达低于正常肝细胞,let-7c能抑制肝癌细胞的增殖,并使细胞阻滞于G1期,CDK6是其调控的靶基因.
关键词： 癌 肝细胞 微小RNAs 细胞周期蛋白依赖激酶6 let-7c -
MiR-34b、靶基因CDK6在骨肉瘤组织中的表达及其临床意义
[目的]探讨miR-34b、靶基因细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)在骨肉瘤中的表达水平及临床意义.[方法]收集2016年3月至2017年3月在本院行开放手术切除术的骨肉瘤组织51例及相应的癌旁正常骨组织(距癌组织边缘至少2cm),采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨肉瘤组织及癌旁正常组织中miR-34b、CDK6mRNA水平,采用免疫组织化学法(S-P)检测骨肉瘤组织及癌旁正常组织中CDK6蛋白表达水平,分析miR-34b、CDK6表达的相关性及二者与骨肉瘤临床病理特征的相关性.[结果]骨肉瘤组织中miR-34bmRNA表达水平为0.34±0.16,明显低于癌旁组织的1.06±0.13,其差异有统计学意义(Z＝24.942,P＝0.000);骨肉瘤组织中CDK6mRNA表达水平为4.37±0.46,明显高于癌旁组织的1.03±0.12(Z＝50.174,P＝0.000),骨肉瘤组织CDK6蛋白阳性表达率较癌旁组织CDK6蛋白阳性表达率高(78.43％vs17.65％,χ2＝37.744,P＝0.000);miR-34b与CDK6表达呈现明显负性相关(r＝－0.483,P＝0.000);miR-34b、CDK6表达与骨肉瘤患者年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置无明显相关性(P＞0.05),与Enneking分期、肿瘤转移密切相关(Z＝2.509、3.962,P＝0.016、0.000;2＝6.451、4.217,P＝0.040、0.040).[结论]miR-34b可能通过调控骨肉瘤组织中靶基因CDK6表达,参与骨肉瘤的发生发展.
关键词： 微RNAs 骨肉瘤/病理学 细胞周期蛋白依赖激酶6 -
宫颈癌组织中CDK6的表达及临床意义
目的 研究细胞周期蛋白依赖激酶6在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理各因素之间的关系.方法 采用免疫组化的实验方法检测30例宫颈癌、30例宫颈上皮内瘤变及30例正常宫颈组织中细胞周期蛋白依赖激酶6的表达情况.结果 细胞周期蛋白依赖激酶6表达水平随着宫颈病变的进展,其阳性表达率逐渐升高,在宫颈癌组织中,细胞周期蛋白依赖激酶6的表达与组织学分化、临床分期及淋巴结转移有关.结论 细胞周期蛋白依赖激酶6在宫颈癌发生发展中起重要作用,且与宫颈癌的侵袭有关,可能作为宫颈癌的一个预后指标.
关键词： 宫颈癌 细胞周期蛋白依赖激酶6 侵袭 -
P21及CDK6与宫颈鳞状细胞癌的关系
目的 观察P21、CDK6在宫颈鳞状细胞癌中的表达情况,探讨其与宫颈鳞状细胞癌的关系.方法 采用免疫组织化学ABC法检测100例宫颈鳞状细胞癌、20例宫颈上皮内瘤变(CIN)及20例正常宫颈组织中P21及CDK6的表达情况,分析他们与癌组织分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期的关系.结果 宫颈鳞状细胞癌组织的P21及CDK6表达率均明显高于CIN组及正常组;P21的低表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移及临床分期(P＜0.05)有关,与肿瘤分化程度(P＞0.05)无关;CDK6的高表达与肿瘤分化程度、浸润深度、淋巴结转移及临床分期(P＜0.05)均有关.结论 P21及CDK6表达异常可能在宫颈鳞状细胞癌的发生、发展中起重要作用;且二者对判断宫颈鳞状细胞癌的预后有一定意义.
关键词： p21 细胞周期蛋白依赖激酶6 宫颈肿瘤 肿瘤 鳞状细胞 -
HPV和CDK6与宫颈癌的相关性研究
目的 研究人乳头瘤病毒E7 (HPV E7)蛋白和细胞周期蛋白依赖激酶6(CDK6)蛋白在宫颈癌组织中的表达及其与临床病理各因素之间的关系.方法 采用免疫组化(S-P)方法检测30例宫颈癌、30例宫颈上皮内瘤变及30例正常宫颈组织中HPV E7蛋白和CDK6蛋白的表达情况.结果 HPVE7蛋白表达阳性率在正常宫颈组织中低于CIN组,差别有统计学意义(x2=4.55,P＜0.05),在CIN组低于宫颈癌组,差别有统计学意义(x2=4.28,P＜0.05);CDK6蛋白表达阳性率在正常宫颈组织中低于CIN组,差别有统计学意义(x2=5.97,P＜0.05),在CIN组低于宫颈癌组,差别有统计学意义(x2=5.40,P＜0.05);在宫颈癌组中CDK6蛋白表达与HPV E7蛋白表达存在正相关(r=0.563,P＜0.05).结论 HPV E7蛋白和CDK6蛋白在宫颈癌组织中表达升高,在宫颈癌的发生发展及侵袭中起重要作用,二者在宫颈癌的发生发展中起到协同作用.
关键词： 宫颈癌 人乳头瘤病毒E7 细胞周期蛋白依赖激酶6 表达
