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东方拟无枝酸菌中基因AORI_2943的敲除对ECO-0501合成的影响
目的 对位于ECO-0501生物合成基因簇内AORI_2943基因进行功能鉴定,进一步解析东方拟无枝酸菌中ECO-0501的生物合成途径.方法 通过同源重组和定点整合的方式构建AORI_2943缺失、回补及过表达突变株.高效液相及质谱分析突变株发酵产物的变化,分析AORI_2943在 ECO-0501合成中的作用.结果 AORI_2943缺失突变株不产ECO-0501和去甲基ECO-0501,只产生结构上缺失了C5N单位(2-氨基-3-羟基环戊-2-烯酮)的前体物质a和b,发酵液中未检测出C5N单位.对缺失突变株回补后,有少量ECO-0501及去甲基ECO-0501产生,同时仍然有大量前体化合物a和b的积累.在野生菌的基础上过表达AORI_2943,并未明显提高ECO-0501的产量.结论 AORI_2943是ECO-0501合成的关键基因,主要参与了ECO-0501前体化合物 C5N单位的合成.
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调控基因对万古霉素生物合成的影响
目的 通过对东方拟无枝酸菌的调控基因进行研究及改造以获得高产万古霉素的突变株.方法 选取经基因组测序分析获得的6个推测具有调控作用的基因:strR型的AORI_1475、araC型的AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531和lysR型的AORI_3398、AORI_7412进行过表达实验.结果 发现AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531的过表达分别将万古霉素产量上调了55%、51%、18%、29%,而AORI_3398、AORI_7412却使万古霉素产量下降了12%左右.结论 初步判断AORI_1475、AORI_1832、AORI_2956、AORI_3531对万古霉素合成有正调控作用,而AORI_3398、AORI_7412对万古霉素合成起负调控作用.
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万古霉素产生菌醋酸钠耐性变株的选育与发酵工艺优化
目的选育万古霉素高产菌种,提高万古霉素发酵效价.方法万古霉素产生菌Amycolatopsis orientalis 1-6经紫外线诱变后筛选醋酸钠耐性变株,并研究了醋酸钠对醋酸钠耐性变株万古霉素发酵的影响.结果获得了万古霉素高产变株A.orientalis 2-17,其发酵效价较出发菌株A.orientalis 1-6提高22%,在发酵培养48 h补入0.2%醋酸钠使高产变株A.orientalis 2-17的发酵效价又提高了13.6%.结论选育前体耐性变株和补加前体可以提高万古霉素的生产能力.
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东方拟无枝酸菌DNA转化系统的建立
对东方拟无枝酸菌HCCB10007原生质体制备和再生条件进行了探索,结果表明以含2%甘氨酸的TSB培养基培养菌丝体,28℃经1mg/ml溶菌酶处理30min,形成的原生质体约达107个/ml,原生质体再生率为2.5%.将来源于HCCB10007的gtfE基因通过安普霉素抗性基因插入失活,构建质粒pLY26并经PEG介导转化HCCB10007原生质体,PCR鉴定结果表明转化成功.
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bgtfA在东方拟无枝酸菌中异源表达及其产物鉴定
在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中异源表达Balhimycin产生菌来源的糖基转移酶基因bgtfA,从而在工程菌发酵液中获得杂合万古霉素,以探索糖基转移酶BgtfA能否作为一个独立的元件在异源宿主中发挥催化作用.首先将bgtfA基因克隆至载体质粒pULVK2AE,构建重组质粒pLYEBA2AE,然后采用电转化方法将质粒导入东方拟无枝酸菌,用HPLC和LC-MS检测、验证工程菌发酵液中是否存在BgtfA的催化产物.成功地在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)异源表达bgtfA基因,经HPLC和LC-MS检测分析,在工程菌的发酵液中获得预期的BgtfA催化产物,杂合万古霉素LYV07ww01.这表明BgtfA有一定的底物宽泛性,不仅能够催化表万古糖胺与balhimycin苷元的连接,还能催化万古糖胺连接至万古苷元.
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Ca2+和Cu2+对东方拟无枝酸菌产生万古霉素的影响
在东方拟无枝酸菌发酵中加入CaCl2@2H20(40mg/L)或CuSO4@5H2O(10mg/L)可分别提高万古霉素产量12%和11%,二者联合加入则有协同作用.Ca2+能使胞内万古霉素浓度降低36%,而Cu2+可使胞内TDP-葡萄糖:糖苷配基万古霉素葡糖基转移酶的活性比对照增强3倍.Ca2+的作用可能是改变细胞对万古霉素的渗透性,而Cu2+可增强万古霉素生物合成酶的活性.
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链霉素抗性突变-万古霉素高产菌株的选育研究
以东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)AO-4为出发菌株,经紫外线(15w,253.7nm,距离30cm)诱变处理,筛选链霉素抗性突变株(链霉素浓度1000μg/ml),从中获得万古霉素高产变株Amycolatopsis orientalis AO-29,其发酵效价较出发菌株提高170%.传代实验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定.
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东方拟无枝酸菌糖基转移酶基因gtfE的克隆
糖基转移酶基因gtfE位于万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)染色体上.通过PCR的方法并对PCR反应条件进行了优化,扩增得到了较高产量的PCR产物.PCR产物经酶切回收后克隆到pBluscriptⅡKS+质粒载体,转化E.coli DH5α感受态细胞,筛选得到一阳性克隆.测序后与文献报道的基因序列做同源比较,结果仅有两个碱基的差异.
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万古霉素产生菌的选育与发酵培养基优化
万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)5-13经紫外线(30W,253.7nm,距离30cm,照射50s)诱变后,在含万古霉素1000μg/ml的浓度梯度平板上筛选万古霉素抗性变株,得到一株万古霉素抗性变株A.orientalis 6-21,其摇瓶效价较出发菌株提高23%,对万古霉素的抗性提高200%.传代试验表明该变株的高产性能遗传特性较稳定.用正交试验法对万古霉素发酵培养基进行了优化,与原发酵培养基相比,万古霉素的摇瓶发酵效价提高了14.3%.
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内源性质粒pXL100的消除影响东方拟无枝酸菌HCCB10007中次级代谢产物的合成
目的 利用分子手段获得东方拟无枝酸菌HCCB10007内源环型质粒pXL100消除突变株,探究大质粒pXL100对于HCCB10007次级代谢产物的影响.方法 利用同源重组的方法将pXL100上疑似编码与质粒复制相关的基因orf37(parA)阻断,同时引入安普霉素抗性基因作为后续的筛选标记.通过EB诱导,影印培养筛选pXL 100消除突变株.比较突变株与原始菌株生长及主要次级代谢产物的变化.结果 通过筛选获得质粒消除突变株HCCB10007-pXL(-),其万古霉素和ECO-0501的产量较原始菌明显下降,分别为原菌株的1/4和1/100.结论 东方拟无枝酸菌HCCB 10007的质粒pXL 100具有调控万古霉素和ECO-0501合成的基因.
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在东方拟无枝酸菌中建立Ⅰ-SceⅠ内切酶介导的无标记敲除系统
目的 在东方拟无枝酸菌中建立由Ⅰ-SceⅠ介导的无标记高效重组系统.方法 首先构建可用于东方拟无枝酸菌的Ⅰ-SceⅠ操作盒,通过敲除多烯类化合物ECO-0501合成相关基因hemA2,比较操作盒使用前后获得hemA2基因双交换突变株的效率.结果 在没有引入Ⅰ-SceⅠ的情况下,随机重组的发生几率仅约2％,而导入后,由于Ⅰ-SceⅠ酶对引入DNA位点的双链切割,导致双交换重组的发生率提高至90％以上.结论 Ⅰ-SceⅠ系统是一种可用于东方拟无枝酸菌无标记遗传操作的有效工具.
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东方拟无枝酸菌HCCB10007内attB位点的人工构建
目的 在万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌HCCB 10007内构建attB整合位点,将噬菌体ΦC31重组酶介导的位点特异性整合系统引入该菌,从而提高该工业菌株的遗传操作效率.方法 在不破坏结构基因的情况下经同源重组将来源于变铅青链霉菌的attB编码序列插入到东方拟无枝酸菌HCCB 10007基因组中,然后将带有绿色荧光蛋白基因(eGFP)的特异性位点重组质粒pLYGYQ2导入该工程菌中.用于验证整合系统的有效性.结果 获得基因组中整合有attB位点的基因工程菌LYGYQA.eGFP 基因顺利整合入所构建的attB位点,并且获得了表达.同时发现该系统的整合效率较同源重组效率提高了约3倍.结论 本研究不但表明来源于链霉菌的位点特异性整合系统可以成功应用于东方拟无枝酸菌中,也证明绿色荧光蛋白基因可以作为报告基因用于该菌的研究.
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东方拟无枝酸菌中ECO-0501生物合成基因簇的筛选及其相关调控基因的初步分析
ECO-0501是从东方拟无枝酸菌代谢物中分离到的一种新型线性多烯类化合物,其不但具有良好的抗菌活性,且体内毒性较低,目前处于临床前的开发.本文通过对东方拟无枝酸菌的菌落原位杂交,筛选到4个粘粒克隆NL5B,NL9-3-1,NL3-1C,NL3-3A,可以覆盖整个ECO-0501生物合成簇,并对其中的基因ORF4进行了生物信息学分析,推测其为ECO-0501合成途径中的正调控基因.并通过该基因的过表达,成功地将ECO-0501的产量提高了6倍,为下一步ECO-0501的开发及其调控机制的研究打下基础.
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产N-demethyl ECO-0501工程菌的构建
ECO-0501是一种在东方拟无枝酸菌(Amycolatopsis orientalis)中分离出的一种新型抗菌化合物.N-demethyl ECO-0501作为ECO-0501生物合成途径的小组分在抗菌活性方面优于ECO-0501.ECO-ORF5(ABM47006.1)编码N-甲基转移酶,负责ECO-0501胍基的甲基化修饰.本研究利用PCR-targeting的方法敲除了产生菌东方拟无枝酸菌HCCB10162的ECO-ORF5,得到了一株高产去甲基ECO-0501的突变株A.orientalis HCCB10370,其产量是东方拟无枝酸菌HCCB10162的3.6倍.
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组合链霉素和利福平抗性突变去甲基万古霉素高产菌株的选育
在去甲基万古霉素生产菌株东方拟无枝酸菌的菌种选育中,利用核糖体工程育种方法,筛选得到的新菌株在发酵水平以及改善气丝及孢子生长贫瘠方面均有较大提高.首轮采用链霉素抗性筛选,得到突变株3-30,斜面外观丰满程度明显好于原对照株,发酵效价提高11.9%;第二轮组合链霉素和利福平抗性结合高能电子诱变育种,进一步巩固了育种成效,得到一系列代谢特点呈多样性的菌株,其中04-102发酵水平较原出发菌株提高45.8%,代谢速度加快,传代稳定性亦得到显著改善.
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东方拟无枝酸菌发酵液小组分的分离鉴定
本文首次从万古霉素产生菌东方拟无枝酸菌的发酵液中分离纯化出三个微量组分LYV09lx01、LYV09lx02、LYV09lx03.考察了摇瓶装量的影响,确定了适合LYV09lx01、LYV09lx02富集的摇瓶发酵条件.LYV09lx03则通过万古霉素水解来富集提取.经筛选获得一种具有特异性吸附作用的弱极性大孔吸附树脂AB-8,结合中压液相色谱及高效液相色谱技术进一步纯化鉴定得到一新结构的异黄酮苷,并对其理化性质及体外活性进行了仞步研究
