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部分发酵类肠杆菌科细菌耐药性及耐碳青霉烯类基因检测分析
目的 检测部分发酵类肠杆菌科细菌对临床推荐用抗生素的敏感性并筛查耐碳青霉烯类基因. 方法 采集鄂西北地区2013年1-12月间住院病人的血、痰、中段尿、前列腺液、分泌物或引流液等,常规琼脂培养法分离发酵类肠杆菌肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、产酸克雷伯菌(Klebsiella oxytoca)、大肠埃希菌(Escherichia coli)、阴沟肠杆菌(Enterbacter cloacae)及沙雷氏菌(Serratia);利用Vitek-2分析系统鉴定菌株并检测其耐药性;PCR法扩增抗碳青霉烯类(亚胺培南和/或美罗培南)菌株耐药基因. 结果 共获得2 291株肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌和沙雷氏菌等分离株,产ESBLs率分别为47.4％、62.6％、9.1％、22.6％;临床推荐用抗生素耐药率:头孢唑啉(Ⅰ)分别为45.4％、73.7％、93.3％、100％,头孢西丁(Ⅱ)分别为17.3％、15.2％、84.9％、33.3％,头孢曲松(Ⅲ)分别为48.4％、65.0％、43.8％、44.4％;阿米卡星分别为17.4％、10.4％、28.1％、24.4％,氨曲南分别为35.4％、38.9％、49.1％、38.9％,亚胺培南(分别为1.8％、1.8％、17.6％、2.4％,美罗培南分别为1.1％、0.8％、6.7％、20％.其中分离出46株耐亚胺培南和/或美罗培南菌株,肺炎克雷伯菌P2964和肺炎克雷伯菌B195携带blaKPC-2基因,肺炎克雷伯菌P6558和产酸克雷伯菌B1645-1携带blaNDM-1基因. 结论 鄂西北地区部分发酵类肠杆菌耐药率呈上升趋势并出现耐碳青霉稀类菌株,菌株间可能存在耐药基因的传递并有造成感染扩散的风险,尤其在住院病人之间,应予以高度重视.
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新生儿科产NDM-1耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌主动外排泵基因acrA的研究
目的 研究主动外排泵基因arcA在耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌中抗生素转录水平,探讨主动外排机制在耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌中的作用. 方法 收集2012年8月-2013年12月中南大学湘雅二医院新生儿科患者的痰及血液标本分离的7株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌株作为实验组,10株同一新生儿科碳青霉烯类敏感肺炎克雷伯菌株作为对照组,采用Phoenix100全自动微生物分析系统进行鉴定及药敏检测,采用KB法和Etest进行表型确认,采用改良Hodge确证试验确定细菌耐药表型,采用RAPD技术检测细菌基因型,采用PCR扩增NDM-1 、acrA基因,采用RT PCR检测acrA mRNA表达. 结果 7株试验菌均产碳青霉烯酶.PCR扩增显示其染色体和质粒上均携带NDM-1基因;RAPD显示 7株试验菌为同一 ST17型;5株试验菌和8株敏感菌株检出外排泵基因acrA;RT-PCR显示试验组和对照组acrA mRNA表达水 平均值分别为0.545和1.899,两组arcA mRNA扩增产物电泳条带与16S rRNA扩增产物电泳条带的灰度比值分别为0.13和0.317,结果进行Fisher精确概率检验,P=0.317＞0.05,差异无统计学意义. 结论 acrA的表达可能不是产NDM 1耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药的必要原 因.
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同时携带blaNDM-1和blaKPC-2基因的一株阴沟肠杆菌检测及临床治疗分析
目的 探讨一株同时携带NDM-1和KPC-2基因的阴沟肠杆菌的耐药机制及其分子传播机制.方法 菌株分离自2013年3月徐州医科大学附属医院的一例慢性阻塞性肺疾病患者的痰液.采用改良Hodge试验和金属酶初筛试验检测菌株是否产碳青霉烯酶;采用聚合酶链反应(PCR)检测blaMUS-1、blaVIM-1、blaVIM-2、blaIMP、blaKPC-2、blaNDM-1、blaOXA-48和blaGES等碳青霉烯酶基因,并对阳性片段进行基因测序;通过质粒接合、转化实验证实耐药基因是否由质粒介导,采用琼脂稀释法检测菌株对常用抗菌药物的敏感性.结果 阴沟肠杆菌改良Hodge试验和金属酶抑制试验均为阳性,PCR产物测序证实该菌株携带NDM-1和KPC-2基因,其中NDM-1基因携带在54×103bp的IncX型质粒上,KPC-2基因携带在42×103bp未分型质粒上.药敏试验发现该菌株仅对四环素(2μg/Ml)和替加环素(1μg/Ml)敏感.患者经替加环素联合哌拉西林/他唑巴坦治疗后症状好转.结论 阴沟肠杆菌携带的NDM-1和KPC-2基因可由质粒介导传播,临床上应结合药敏试验治疗该菌引起的感染.
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携带NDM-1肠杆菌科细菌临床感染特点及流行病学特征
NDM-1是一种新型的金属β-内酰胺酶,又称为新德里金属β-内酰胺酶-1.产NDM-1细菌常对包括碳青霉烯类在内的所有 β-内酰胺类抗生素耐药[1].自2008年Yong等[2]首次报道之后,blaNDM-1在世界范围内开始播散流行,给临床抗感染治疗带来极大挑战,对感染防控构成严重威胁.由于NDM-1具有严重耐药性和播散速度快的特点,已成为全球重点关注的问题.在中国,大多数已发现的产NDM-1菌株属于不同序列型(Sequence type, ST),呈散在分布.但Jin 等[3]报道山东省发现产NDM-1肺炎克雷伯菌的小范围暴发流行.因此,加强对这些菌株的监测,有助于临床抗感染治疗,有效的预防与控制这些菌株在医院感染的发生、流行和暴发.为了阐明携带NDM-1基因菌株临床感染特点及流行病学特征,本研究对分离自我院的17株携带NDM-1基因菌株感染患者的临床资料进行了回顾性分析,同时采用多位点序列分型(Multilocus sequence typing,MLST)技术对测试菌株进行了分型,报道如下.
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耐亚胺培南肺炎克雷伯菌的耐药机制研究
目的：探讨耐亚胺培南肺炎克雷伯菌的流行病学特征和β‐内酰胺酶基因型，为临床合理用药和感染控制提供依据。方法收集2014年2－11月临床分离25株耐亚胺培南肺炎克雷伯菌，采用VIT EK‐2微生物系统检测菌株的药物敏感性；改良 Hodge试验检测碳青霉烯酶；PCR检测β‐内酰胺酶基因 KPC‐2、SHV、CTX‐M、IM P、VIM、NDM‐1、OXA‐48；采用肠杆菌科基因间一致重复序列聚合酶链技术（ERIC‐PCR）对菌株进行同源性分析。结果在检测的18种药物中，哌拉西林／他唑巴坦、氨苄西林／舒巴坦、头孢唑林、头孢曲松、氨苄西林、厄他培南、亚胺培南、氨曲南的耐药率均为100．0％，磺胺甲噁唑／甲氧苄啶的耐药率低为32．0％，其次为阿米卡星和妥布要素均为（68．0％）；改良H o dg e试验阳性20株（80．0％）；25株菌均检测到 S H V基因，20株菌检测到CTX‐M基因，15株检测到KPC‐2基因，1株菌检测到 IMP‐4基因，3株菌检测到NDM‐1基因，未检测到 VIM、OXA‐48基因；25株菌分为6型，为A、B、C、D、E、F ，分别有15、5、2、1、1、1株。结论耐亚胺培南的肺炎克雷伯菌多药耐药严重，产生β‐内酰胺酶是菌株对多种药物耐药的主要机制，且菌株存在克隆性传播，3株菌检测到NDM‐1基因，应引起相关部门的重视。
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产气肠杆菌新德里金属β-内酰胺酶质粒分子特征分析
目的：分析产气肠杆菌携带 blaN DM‐1质粒的转移性、质粒复制子分型及 blaN DM‐1的基因环境。方法产气肠杆菌 HN‐NDM0711为研究对象，接合实验鉴定质粒转移性，PCR方法对质粒复制子分型，染色体步移技术对blaNDM‐1上下游测序，基因组序列比对使用BLASTN和BLASTP ，注释使用Vector NTI 11．5．1。结果产气肠杆菌 HN‐NDM0711接合实验阳性，质粒复制子为IncA／C型；blaNDM‐1位于不常见的插入序列ISAba14和IS91之间；在blaNDM‐1上游出现一个Tn3转座子和I型整合子，整合子上含有一个由庞大镶嵌序列构成的罕见耐药基因盒。结论 IncA／C型质粒pHN‐NDM0711携带blaNDM‐1及耐药基因盒来源于不同抗菌药物选择压力环境下的基因重组。只有严格控制临床、工业和农业抗菌药物的合理使用才能从源头上减少此类细菌的产生。
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宁夏地区某医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌临床分布及耐药基因的分析
目的 探讨医院耐碳青霉烯类肠杆菌科细菌(CRE)的临床分布特点、耐药情况及耐药机制,以便指导临床医生合理使用抗菌药物.方法 采用WHONET5.6软件统计医院2014年1月-2016年12月所有检出的CRE菌株,MIC法检测药敏结果,改良Hodge试验和EDTA协同试验检测是否产碳青霉烯酶;用PCR技术检测碳青霉烯酶的耐药基因并进行测序.结果 共分离CRE 70株,以阴沟肠杆菌28株和肺炎克雷伯菌23株为主;主要分布在肝胆外科;对青霉素类及头孢类抗菌药物的耐药率均＞90％;改良Hodge试验和EDTA协同试验阳性率分别为77.1％和87.1％;NDM-1耐药基因阳性率高,为75.7％,其余耐药基因KPC-2、IMP-4阳性率分别为17.1％与11.4％,其中3株同时携带两种耐药基因,未检出GES-4、VIM-2、OXA-48耐药基因.结论 碳青霉烯酶耐药基因以NDM-1为主,医院需加强细菌的耐药监测,合理使用抗菌药物,防止感染的暴发性流行.
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我国携带 NDM-1基因耐药菌流行现况分析
目的：分析我国新德里金属β-内酰胺酶（NDM-1）阳性菌的流行病学特征，探讨携带 NDM-1阳性菌的耐药机制。方法收集2010～2015年报道我国 blaNDM-1流行情况文献，对 NDM-1阳性菌株种类与地区分布、阳性菌株和感染来源、耐药谱和转移机制进行流行病学分析。结果我国共有25个省市发现 blaNDM-1阳性菌株，其中广东地区高（39．49％，P ＜0．05），阳性菌以肺炎克雷伯菌和阴沟肠杆菌多（P ＜0．05）；感染阳性菌的患者年龄段主要集中在10岁以下、60～80岁之间（P ＜0．05），痰液标本分离 blaNDM-1阳性菌多，为40株（41．24％，P ＜0．05）， ICU、儿科和呼吸科分离 blaNDM-1阳性菌显著高于其他科室（P ＜0．05），肺部疾病患者分离出阳性菌多（P ＜0．05），blaNDM-1阳性菌对阿米卡星、替加环素的耐药率低，分别为7．69％和2．33％。结论携带 NDM-1基因的耐药菌感染已成为全球性的公共卫生问题，而且在年龄、地区及来源等方面存在显著差异，需进一步开展主动监测，深入研究其发生发展规律。
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新德里金属β-内酰胺酶NDM-1的研究进展
2010年首次报道的新德里金属β-内酰胺酶(NDM-1)能水解几乎所有β-内酰胺类抗生素,产生NDM-1的菌株被称为“超级细菌”.由于缺乏有效的抗生素,目前临床上还没有能够完全治愈超级细菌感染的方法.因此针对超级细菌抑制剂的创新药物研究已经成为一个充满挑战的研究方向.本文对NDM-1抑制剂的研究现状、抗药原理及发展前景等做了详细的分析、整理和阐述.
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“超级细菌”NDM-1的研究进展
新德里金属β-内酰胺酶-1(new delhi metallo-β-lactamase-1,NDM-1)能够水解除氨曲南以外几乎所有的β-内酰胺类抗生素,导致其广泛耐药,给临床治疗带来很大困难.临床有效抑制剂的缺乏,与MBLs活性位点结构的多样性有关,如金属离子配位残基及活性位点周围loop区结构的多变性,目前临床还没有针对NDM-1有效的抑制剂.本文就携带耐药菌的分布、晶体结构、活性中心结构及周围重要氨基酸残基、催化水解机制及其抑制剂等的研究进展进行分析、整理和总结.
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滥用抗生素催生"超级细菌"
近期一种被命名为"NDM-1"的细菌成为人们关注的焦点,由于它可以抵抗现有的几乎所有的抗生素,被称为"超级细菌".这种细菌初在印度首都新德里做过手术的人身上被发现,因此被称为"新德里金属β-内酰胺酶-1(New Delhi metallo-β-lactamase 1,简称NDM-1)".NDM-1是一种新的超级耐药基因,可编码一种罕见的金属酶,能水解几乎所有的β-内酰胺类抗生素,它可存在于大多数细菌的DNA线粒体中,从而使细菌产生广泛的耐药性[1].
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鲍曼不动杆菌产NDM酶的基因研究进展
NDM-1是一种新型金属β-内酰胺酶,自2008年被首次发现,便吸引了公众及研究者的目光.随之NDM的不同亚型也相继被报道.该文章主要对NDM-1及NDM-2分子特点及结构、基因序列及不同亚型的研究进展作一综述.
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碳青霉烯类耐药大肠埃希菌耐药机制研究
目的 研究碳青霉烯类耐药大肠埃希菌的的耐药机制.方法 收集本院2011年8月至2012年8月的碳青霉烯类耐药大肠埃希菌,采用琼脂稀释法进行药敏试验;改良Hodge试验筛查菌株是否产碳青霉烯酶;利用聚合酶链反应扩增KPC、IMP、VIM、NDM、SHV、TEM、CTX-M-1组、CTX-M-9组耐药基因,并对扩增产物进行测序.结果 21株实验菌均为多重耐药菌,对17种抗菌药物中耐药率＞60％的有11种,其中耐药率＞90％的有5种,分别为头孢他啶、头孢噻肟、头孢西丁、环丙沙星和氨曲南.耐药率低的为多粘菌素B,均表现为敏感.9株改良Hodge试验阳性.6株携带碳青霉烯类耐药基因(3株NDM-1阳性、3株IMP阳性).共有18株检出β-内酰胺类耐药基因.结论 该院碳青霉烯类耐药大肠埃希菌携带的碳青霉烯酶基因以NDM-1和IMP基因较常见.
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如何正确认识NDM-1超级细菌
NDM-1 (New Delhi metallo-β-lactamase-1)是一种新近发现的新的金属β-内酰胺酶,携带NDM-1基因的细菌对包括碳青霉素烯类在内的几乎所有抗生素耐药,被称为“超级细菌”.本文从“超级细菌”NDM-1的发现、我国的超级细菌现状、耐药菌的严峻形势及NDM-1的治疗等方面作了详尽阐述.
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NDM-1基因的克隆表达及生物信息学分析
目的 克隆鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因,对NDM-1进行生物信息学分析,表达并纯化重组NDM-1蛋白.方法 PCR扩增鲍曼不动杆菌NDM-1的blaNDM-1基因,克隆至pMAL-p2X质粒,构建重组原核表达质粒pMAL-p2X::NDM-1,对NDM-1进行生物信息学分析.将重组表达质粒转化大肠杆菌Tb1,IPTG诱导表达,经亲和层析纯化重组蛋白MBP-NDM-1.结果 重组表达质粒pMAL-p2X::NDM-1经双酶切和测序证实构建正确;生物信息学分析表明,NDM-1的相对分子质量为28 487.86,等电点为5.89,1～28氨基酸为NDM-1的信号肽序列,与其他亚型金属β-内酰胺酶同源性很低;表达的重组蛋白相对分子质量约73000,主要以可溶形式表达;纯化后的重组蛋白浓度为1.72mg/ml.结论 表达并纯化了可溶性重组蛋白MBP-NDM-1,为后续NDM-1活性功能及其抑制剂的研究奠定了基础.
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8株携带blaNDM-1基因阴沟肠杆菌耐药性研究
目的 对南昌大学第一附属医院发现的8株携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌进行相关耐药性研究.方法 2016年1月-2017年6月该院分离的501株阴沟肠杆菌中筛选145株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆菌,对其进行blaNDM-1基因筛查;运用改良碳青霉烯灭活试验(mCIM)进行碳青霉烯酶表型筛查;采用VITEK 2-Compact全自动微生物分析系统进行菌株体外药物敏感性试验;采用肠杆菌基因重复一致序列(ERIC)-PCR技术对blaNDM-1基因阳性菌株进行同源性分析.结果 145株对碳青霉烯类抗生素不敏感的阴沟肠杆中检出8株携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌,未发现其同时携带其他碳青霉烯酶基因;8株携带blaNDM-1基因的阴沟肠杆菌mCIM表型试验显示产碳青霉烯酶.药敏结果分析发现其对碳青霉烯类、头孢菌素类和青霉素类抗生素耐药率高.ERIC-PCR结果显示这8株blaNDM-1基因阳性的阴沟肠杆菌可以大致分为4个不同的基因指纹图谱型,且其在该院内存在部分克隆传播.结论 该院对碳青霉烯类耐药阴沟肠杆菌主要是因携带blaNDM-1基因,由此产生NDM-1型碳青霉烯酶致该类细菌高度耐药,当引起重视.
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弗劳地枸橼酸杆菌中质粒介导的KPC-2和NDM-1型碳青霉烯酶基因结构分析
目的 对携带blaNDM-1和blaKPC-2的弗劳地枸橼酸杆菌的碳青霉烯酶基因结构进行分析.方法 收集4株耐碳青霉烯类药物弗劳地枸橼酸杆菌(CF-05、CF-17、CF-35、CF-43),琼脂稀释法测定抗菌药物敏感性;脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析细菌同源性;特异性PCR扩增和序列测定分析碳青霉烯酶耐药基因和ESBLs耐药基因、接合试验、耐药基因周围序列分析对菌株的耐药机制进行分子水平研究.结果 4株细菌仅CF-05对阿米卡星敏感,所有菌株对其他检测药物全部耐药;PFGE结果显示4株细菌不同源;特异性PCR扩增和序列分析显示2株(CF-35、CF-43)同时携带blaNDM-1和blaKPC-2、另2株(CF-05、CF-17)仅携带blaNDM-1,CF-35同时携带blaCTX-M-15;其中3株细菌(CF-05、CF-17、CF-43)接合成功,CF-05、CF-17接合子(CF-05-1和CF-17-1)携带blaNDM-1,CF-43获得2种接合子(CF-43-1携带blaKPC-2、CF-43-2同时携带blaNDM-1和blaKP-2);分析blaNDM-1和blaKPC-2周围序列发现,4株细菌周围序列分别与国内报道携带blaNDM-1和blaKPC-2的肺炎克雷伯菌质粒pNDM-HN380和PK048周围序列高度相似.结论 在4株弗劳地枸橼酸杆菌中检测到NDM-1型碳青霉烯酶,其中2株同时携带KPC-2型碳青霉烯酶,blaNDM-1周围序列和blaKPC-2周围序列与国内已知肺炎克雷伯菌相关耐药基因周围序列高度相似.
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多肽突变体Cbf-14-2抗青霉素耐药细菌的活性研究
本研究主要探讨了新型多肽突变体Cbf-14-2对携带NDM-1基因重组菌(E.coli BL21(DE3)-NDM-1)的抗菌活性及机制.实验采用肉汤倍比稀释活菌计数法测定多肽对E.coli BL21(DE3)-NDM-1重组菌的MIC/MBC和杀菌曲线,评价多肽的体外抗菌活性;采用重组菌腹腔感染法建立小鼠败血症模型,评价多肽的体内抗菌活性;通过Zeta电位分析和流式细胞术探讨Cbf-14-2抗耐药细菌感染的作用机制.结果表明,多肽Cbf-14-2对携带NDM-1基因的耐药细菌具有良好的抗菌活性(MIC=16 μg/mL),能在2h内快速杀灭细菌;同时,多肽能显著降低感染小鼠肝、脾、肺和肾脏等组织的细菌负载量,对细菌显示出强效清除能力,将小鼠存活率由10％提高至70％.这主要由于Cbf-14-2能与细菌细胞膜表面负电荷发生静电结合,增加对膜的穿透能力.因此,Cbf-14-2有望成为治疗NDM-1耐药细菌诱发感染的潜在抗菌剂.
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NDM-1基因在不动杆菌属菌株中的分布调查
目的 调查NDM-1基因在不动杆菌属菌株中的分布情况.方法 收集亚胺培南耐药的鲍曼不动杆菌25株、非鲍曼不动杆菌5株(分别为洛菲不动杆菌3株和琼氏不动杆菌2株).采用改良Hodge试验及双纸片协同试验进行碳青霉烯酶表型筛选;PCR和DNA测序方法检测碳青霉烯酶基因;接合试验探讨耐药基因的可传递性;PFGE调查菌株的同源性.结果25株鲍曼不动杆菌改良Hodge试验阳性10株,金属酶表型试验均阴性,均检出OXA-23-like基因,未检出NDM-1基因;5株非鲍曼不动杆菌金属酶表型试验均阳性,均携带NDM-1基因,改良Hodge试验均阴性;PFGE显示鲍曼不动杆菌同源性较高,主要为A克隆株,而NDM-1阳性菌株不具同源性.NDM-1阳性菌株接合试验未获成功.结论 本院碳青霉烯类耐药不动杆菌属菌株中NDM-1基因分布在非鲍曼不动杆菌中,且为散发.
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鲍曼不动杆菌blaNDM-1基因序列分析及表达
目的 研究NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株耐药性产生的分子机制.方法 Vitek32测定耐药谱.根据GenBank发表blaNDM-1基因序列设计合成引物,利用PCR技术扩增NDM-1鲍曼不动杆菌的blaNDM-1结构基因及其上下游调控序列片段,连接T载体,转化至大肠杆菌E.coli DH5α,序列测定并进行BLAST分析比对.测定始发菌株与重组菌株对美洛培南的小抑菌浓度.结果 药敏试验结果 显示,该菌株对碳青霉烯类及β-内酰胺类抗生素耐药.NDM-1鲍曼不动杆菌厦门分离株blaNDM-1基因与HK-01同源性为100%;与KP-05-506相比,在blaNDM-1和trpF之间有24 bp的插入.美洛培南小抑菌浓度测定结果 表明,重组菌株E.coli DH5α(pMD18-T::blaNDM-1)MIC值比始发菌株E.coli DH5α升高256倍.结论 获得blaNDM-1基因的大肠杆菌能够表达碳青霉烯酶,该基因是碳青霉烯类抗生素耐药性产生的分子基础,该基因具有跨种水平传播的可能.
关键词： NDM-1 鲍曼不动杆菌 blaNDM-1基因 序列分析
