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旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446小细胞肺癌的抑制作用
目的 研究旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446小细胞肺癌的抑制作用.方法 试验随机分为3组.A组(实验组):将提取的旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白用无血清培养基稀释成浓度为0.075、0.15和0.3 mg/ml,分别与H446细胞共培养;B组(标准对照):将顺铂稀释成12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4和0.2μg/ml,分别与H446细胞共培养;C组(空白对照组):H446细胞培养过程中不作任何处理.采用噻唑蓝比色法(MTT法)检测各组不同时间细胞抑制率;采用原位末端转移酶标记法(TUNEL法)观察细胞凋亡情况.结果 MTT法检测各实验组细胞抑制率均随药物浓度的增高和作用时间的延长而升高,与空白对照组比较差异有统计学意义(P＜0.01);TUNEL法检测A、B、C组细胞凋亡率分别为85％、43％和2％,差异有统计学意义(P＜0.01);A组与B组比较差异有统计学意义(P＜0.01).结论 旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446细胞有抑制作用,可能是潜在的抗小细胞肺癌的生物制剂.
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旋毛虫成虫排泄分泌蛋白组分分析
目的 通过“鸟枪法” (shotgun技术)分析旋毛虫(Trichinella spiralis)成虫排泄分泌蛋白(adult worm excretory/secretory protein,AWESP)的组分,寻找其调节人炎症性肠炎的活性成分. 方法 制备旋毛虫AWESP,经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离酶解后,采用shotgun液相色谱-串联质谱系统鉴定,将分析所得的数据通过Masco软件进行数据库检索,完成蛋白的鉴定,并对鉴定出的蛋白从细胞组分、分子功能和生物学途径3个方面进行Gene Ontology (GO)分类. 结果 SDS-PAGE分离的旋毛虫AWESP相对分子质量(Mr)约15 000～116 000,质谱分析共获得280个蛋白,通过Masco软件检索已鉴定的蛋白为96种,假定的蛋白为98种,未鉴定的蛋白为86种.已初步发现至少有4种蛋白可能具有潜在的调节人炎症性肠炎的作用,包括半胱氨酸蛋白酶抑制剂、丝氨酸蛋白酶、53 000排泄/分泌抗原和谷胱氨肽转移酶.GO工具分析显示,已鉴定的蛋白具有104种分子功能,参与了363种生物过程. 结论 经Masco软件检索,旋毛虫AWESP成分复杂多样,已鉴定的蛋白有96种,从已明确的蛋白中初步筛选出4种与调节人炎症性肠炎潜在相关的蛋白.
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质谱法分析旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白的组分
目的 分析旋毛虫( Trichinella spiralis)肌幼虫排泄分泌蛋白(excretory-secretory protein,ESP)的组分,寻找其抗肿瘤活性组分.方法 收集纯净的旋毛虫脱囊肌幼虫,制备旋毛虫肌幼虫ESP.采用15％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离ESP,将分离获得的所有蛋白条带进行胰蛋白酶酶解,采用液质联用质谱法(LC-MS/MS)进行鉴定.利用Gene Ontology (GO)对已鉴定蛋白质进行细胞组分、分子功能和生物过程的富集分析.结果 经SDS-PAGE电泳分离获得清晰的蛋白质条带,相对分子质量(Mr)为10 000～142 000.质谱分析共鉴定出162种蛋白质,其中63种为已明确鉴定的蛋白质,34种为假定蛋白质,65种为未鉴定的蛋白质.鉴定出6种与抗肿瘤相关的蛋白质,即原肌球蛋白、组蛋白H2A、剪切聚腺苷酸化特异因子亚基2、Kazal 4型丝氨酸蛋白酶抑制剂、犰狳极性蛋白和真核起始因子4A.GO富集分析显示,已鉴定的蛋白质具有54种不同的分子功能,参与细胞构成并参与382种生物过程.结论 旋毛虫肌幼虫ESP组分复杂,有多种未鉴定的蛋白质,从已知的63种蛋白质中筛选出6种与抗肿瘤相关的蛋白质.
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旋毛虫排泄分泌蛋白对小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响
目的 研究旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对人小细胞肺癌NCI-H446细胞凋亡的影响. 方法 旋毛虫肌幼虫培养24 h,收集培养液,取上清,即为旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白.将人小细胞肺癌NCI-H446细胞(编号A054)随机分为3组,实验组(A组)和细胞凋亡组(B组)的NCI-H446细胞(5×106/ml)分别与旋毛虫排泄分泌蛋白(终浓度为0.3 mg/ml)和顺铂(6.4 μg/ml)共培养24 h,空白对照组(C组)的NCI-H446细胞培养24 h,不作任何处理.RT-PCR检测3组NCI-H446细胞中凋亡抑制基因Bcl-2、凋亡相关基因Fas和Fas配体(Fasl) mRNA的表达水平.以抗原癌基因C-myc标签鼠单克隆抗体为一抗,蛋白质印迹(Western blotting)检测3组细胞C-myc蛋白的表达情况.免疫荧光检测3组NCI-H446细胞中C-myc蛋白阳性表达情况. 结果 RT-PCR结果显示,经旋毛虫排泄分泌蛋白处理的NCI-H446细胞(A组),Bcl-2 mRNA相对表达水平低,为(0.575±0.047),与B(0.850±0.073)、C组(0.975±0.069)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).A组Fas mRNA相对表达量高,为(0.975±0.115),B(0.817±0.121)、C组(0.769±0.061)相对较低(P＜0.05).A、B和C组细胞Fasl mRNA相对表达水平分别为0.669±0.051、0.787±0.124、0.875±0.125 (P＜0.05).A、B和C组细胞Fas/Fasl mRNA比值分别为1.475、1.038和0.878.Western blotting分析结果显示,A组C-myc相对表达水平低(0.566±0.054),B(1.074±0.069)、C组(1.172±0.026)相对较高(P＜0.05).免疫荧光定位结果显示,旋毛虫排泄分泌蛋白和顺铂作用后24h,C-myc蛋白在细胞浆/细胞核表达. 结论 旋毛虫排泄分泌蛋白可促进人小细胞肺癌细胞系NCI-H446细胞凋亡,可能是通过调节凋亡蛋白C-myc表达、进而抑制Bcl-2 mR-NA的表达并调节Fas/Fasl mRNA比例来实现的.
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旋毛虫排泄分泌蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用
采用MTT法检测旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对人肝癌HepG2细胞增殖的抑制作用.AO/EB荧光染色观察与300 μg/ml排泄分泌蛋白共培养24 h的HepG2细胞的细胞核形态.用75 μg/ml排泄分泌蛋白作用HepG2细胞24 h后,流式细胞术(FCM)分析细胞凋亡率,免疫荧光法检测细胞cleaved-caspase 9的表达.结果显示,旋毛虫排泄分泌蛋白呈剂量依赖性抑制人肝癌HepG2细胞的增殖.300 μg/ml排泄分泌蛋白作用24 h后,HepG2细胞核固缩呈圆珠状凋亡特征.75 μg/ml排泄分泌蛋白作用细胞24 h后,细胞早期和晚期凋亡率分别为17.9％和7.3％,细胞坏死占6.6％;HepG2细胞中cleaved-caspase 9荧光强度明显高于阴性对照.
关键词： 旋毛虫 排泄分泌蛋白 肝癌HepG2细胞系 凋亡 -
旋毛虫及其虫源性蛋白对盲肠结扎穿孔诱导的小鼠脓毒症的影响
目的：观察旋毛虫及其虫源性蛋白对盲肠结扎穿孔（CLP）诱导的小鼠脓毒症的影响。方法80只雄性BALB/c小鼠随机分为假手术组、CLP组、旋毛虫肌幼虫（ML）预感染组、旋毛虫肌幼虫虫体可溶性蛋白（SMP）处理组和排泄分泌蛋白（MES）处理组。ML预感染组于术前28 d经口感染300条旋毛虫肌幼虫，其余各组分别于术后30 min腹腔注射PBS或SMP（25μg/只）或MES（25μg/只）。观察小鼠术后状态和72 h生存率，检测术后12 h小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）和肌酐（Cr）水平及TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、TGF-β水平，观察小鼠肝和肾组织病变。结果与假手术组相比，CLP组72 h生存率降低，血清中ALT、AST、BUN和Cr水平及细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10和TGF-β水平均明显升高（P<0.05）。肝中肝索排列紊乱，肝细胞水肿，肾中部分血管球皱缩，肾小管细胞水肿。与CLP组相比，ML预感染组血清中ALT、AST、Cr、TNF-α和IL-1β水平降低，IL-10和TGF-β水平升高（P<0.05）；SMP处理组血清中ALT、AST、Cr、TNF-α和IL-1β水平降低，TGF-β水平升高（P<0.05）；MES处理组72 h生存率明显升高，血清中ALT、AST、BUN、Cr、TNF-α、IL-6和IL-1β水平明显降低，IL-10和TGF-β水平明显升高（P<0.05），肝和肾组织结构损伤明显减轻。结论旋毛虫及其虫源性蛋白可减少CLP诱导的脓毒症小鼠血清中促炎因子的释放，促进免疫调节因子的释放，其中MES效果更为显著，并能减轻肝和肾结构和功能的损伤。
