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肺癌细胞A549抗原相关旋毛虫Tsp06172基因的克隆及原核表达
目的 克隆旋毛虫(Trichinella spiralis)与肺癌细胞A549相关抗原Tsp06172基因,并进行原核表达. 方法 采用RT-PCR方法扩增Tsp06172基因,连接原核表达载体pET-28a,转化入感受态细胞BL21,IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western blot鉴定表达产物. 结果 重组表达质粒经双酶切及测序鉴定正确.表达分子质量单位约为16 ku的融合蛋白.Western blot检测融合蛋白能被抗A549细胞的多克隆抗体识别. 结论 构建的原核表达载体pET-28a Tsp06172表达具有A549细胞反应原性的蛋白,为旋毛虫Tsp06172重组蛋白功能的研究了奠定基础.
关键词： 旋毛虫 Tsp06172基因 原核表达 肺癌细胞A549 -
鸦胆子油乳对肺癌细胞A549的抑制作用及其机制
目的 研究鸦胆子油乳对肺癌细胞A549的抑制作用,并初步探讨其相关作用机制.方法 以不同终质量浓度的鸦胆子油乳(0.50,1.25,2.50 g·L-1)作用于肺癌细胞A549,并将其作为低、中、高3个质量浓度实验组,同时设置对照组(给予等量0.9％ NaCl).用4,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色法检测各组肺癌细胞A549凋亡的形态学变化,用噻唑蓝(MTr)法和免疫印迹法检测各组肺癌细胞A549增殖抑制情况及凋亡抑制蛋白Survivin表达情况.结果 干预24h后,对照组及低、中、高3个质量实验组肺癌细胞A549增殖抑制率分别为(0.31±0.19)％,(37.24±6.21)％,(49.33±5.96)％,(61.25±6.23)％,干预48 h后,增殖抑制率分别为(0.32±0.21)％,(58.14±6.33)％,(65.28±5.79)％,(73.46±5.37)％,干预72 h后,增殖抑制率分别为(0.38±0.23)％,(68.58±5.87)％,(76.35±6.02)％,(83.97±5.64)％.与对照组比较,实验组肺癌细胞A549增殖抑制率显著升高(P＜0.01),且随着鸦胆子油乳质量浓度增大和作用时间延长,肺癌细胞A549增殖抑制率呈逐渐升高趋势(P ＜0.05或P＜0.01).对照组和低、中、高3个质量浓度实验组Survivin蛋白灰度值分别为0.95±0.07,0.83±0.10,0.66±0.12,0.51±0.09;对照组和实验组比较,差异均有统计学意义(均P＜0.01),且随鸦胆子油乳质量浓度增加,Survivin蛋白表达量呈逐渐降低趋势(P＜0.01).结论 鸦胆子油乳可显著抑制肺癌细胞A549增殖,并诱导其凋亡,相关作用机制可能是其可有效抑制肺癌细胞A549中凋亡抑制蛋白Survivin的表达.
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黄芪甲苷对人参皂苷CK肿瘤细胞摄取及抗肿瘤作用的影响
目的 考察黄芪甲苷(AS-Ⅳ)对人参皂苷CK (GCK)肿瘤细胞摄取和抗肿瘤药效的影响.方法 采用人非小细胞肺癌细胞A549作为肿瘤细胞模型,通过MTT法比较两者配伍与单用GCK的细胞毒性;用荧光法和HPLC法考察了AS-Ⅳ与配伍GCK后细胞对GCK的摄取率变化,建立裸鼠荷瘤模型考察AS-Ⅳ对GCK的体内增效作用.结果 配伍AS-Ⅳ后,GCK对A549细胞的生长抑制作用增强,肿瘤细胞对GCK的摄取增加,且随着AS-Ⅳ比例的升高,效果更加显著.荷瘤小鼠实验表明,AS-Ⅳ增加了GCK的体内抗肿瘤作用.结论 AS-Ⅳ配伍GCK具有增强GCK抗肿瘤药效的作用.
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芹菜素对肺癌细胞氨肽酶N抑制作用机制的研究
目的：探讨芹菜素对肺癌细胞氨肽酶N活性的影响及其对肺癌细胞A549生长抑制作用的机制。方法采用酶抑制动力学方法，观察芹菜素对氨肽酶N的抑制作用和延滞时间；进行肺癌细胞A549和肺正常细胞MRC-5生长的抑制试验；通过锌离子螯合实验和分子对接研究芹菜素与氨肽酶N的相互作用机制。结果芹菜素能够对肺癌细胞A549的生长产生抑制作用，对正常细胞MRC-5具有较低的毒性，且是一种可逆的竞争型氨肽酶N抑制剂[半数抑制浓度(IC50)为(71.22±2.43)μmol/L]；锌离子螯合实验和分子模拟结果表明，芹菜素能够优先结合到氨肽酶N的活性中心锌离子附近，并与催化基团His383和Glu350形成氢键。结论芹菜素是一种竞争性的氨肽酶N抑制剂，能够特异性地对肺癌细胞A549的生长起到抑制作用。
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蛞蝓提取物对人肺癌细胞A549的抑制作用
目的:了解蛞蝓提取物对人肺癌细胞A549的抑制作用及对细胞形态学的影响.方法:用MTT法测定蛞蝓提取物对A54 9细胞的增殖抑制率,并观察其形态学变化.结果:蛞蝓提取物能抑制A549细胞的增殖,抑制率为11.1％ ～66.51％;镜下可见肺癌细胞呈变小、变少、破碎裂解等变化.结论:蛞蝓提取物对人肺癌A549细胞有显著的抑制作用.
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苦瓜药用有效成分的提取及诱导肺癌细胞凋亡的作用
目的：探讨苦瓜药物有效成分的提取及诱导肺癌细胞凋亡的作用。方法提取新鲜苦瓜蛋白，配置成不同浓度梯度溶液5、10、15、20、50μg ／ml（干预组），分别干预 A549细胞不同时间6、12、24、48、36 h，凋零组只加培养液、对照组（0μg ／ml）不干预，操作步骤与干预组均相同，四甲基偶氮唑盐比色法（MTT ）测定细胞抑制率，TUNEL 法测定细胞凋亡率，倒置显微镜下观察细胞凋亡形态。结果干预24、36、48 h 时，浓度为5～50μg ／ml。不同浓度梯度细胞 OD 值分别与相应的对照组相比，差异均具有统计学意义（ P＜0．05）；苦瓜蛋白与细胞抑制率间存在明显剂量－反应关系（r ＝0．453，P＜0．05）；选择细胞抑制率在50％以下的浓度梯度分别为0、5、10、15、20μg ／ml，对 A549细胞干预24 h，细胞凋亡率分别为（2．69±0．35）％、（12．30±0．28）％、（42．23±2．31）％、（31．67±1．25）％、（35．25±2．41）％，其中苦瓜蛋白在10μg ／ml 时细胞凋亡率高。结论苦瓜蛋白对于肺癌细胞具有明显的抑制作用，并且促进细胞凋亡率。
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基于内吞作用途径的三叶青黄酮抗肺癌细胞A549的miRNA调控作用
目的:探讨三叶青黄酮抑制肺癌细胞A549增殖、侵袭及诱导凋亡的机理.方法:通过miRNA-seq结合生物信息学技术,分析三叶青黄酮处理肺癌细胞A549后细胞miRNA参与调控增殖抑制、侵袭抑制和凋亡诱导的作用途径.结果:三叶青黄酮处理肺癌细胞A549后,差异表达已知miRNA靶基因KEGG聚类分析显示细胞内吞作用途径显著富集,且该途径中靶基因与肿瘤细胞发生与发展存在密切关系.结论:基于内吞作用途径的miRNA调控作用是三叶青黄酮抑制肺癌细胞A549增殖和侵袭及诱导凋亡的重要机理之一.
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丙戊酸钠抑制肺癌细胞株A549增殖的研究
目的 研究丙戊酸钠(sodium valproate,VPA)对肺癌细胞株A549细胞增殖的影响.方法 体外不同浓度VPA不同作用时间处理人肺癌细胞株A549,倒置显微镜观察细胞形态变化,MTT比色法检测细胞增殖,流式细胞技术分析细胞周期与细胞凋亡的改变.结果 2.0 mmol/L VPA作用72 h细胞形态明显改变、细胞数明显减少.1.0 mmol/L VPA作用72 h后,细胞增殖被抑制,抑制率为(15.8±2.8)%,与同期对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05);提高处理浓度或延长作用时间,抑制作用有加强趋势.1.0 mmol/L VPA作用72 h后可改变细胞周期分布,G1期细胞比例为(72.2±3.4)%,与同期对照组相比差异显著;2.0 mmol/LVPA处理24～72 h后G1细胞比例由(64.5±3.7)%增加至(79.8±4.4)%,而S期细胞由(30.7±5.17)%降低至(14.2±3.37)%;提高处理浓度或延长作用时间均使G1期细胞比例增高,S期细胞比例减少.2 mmol/L VPA作用24～72 h可提高细胞凋亡率,由(7.30±1.87)%增加到(19.85±2.40)%.结论 VPA可抑制肺癌A549细胞生长,改变细胞周期分布、促进细胞凋亡.
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恩度促进与肺癌细胞A549共培养体系中的HUVEC凋亡及其机制研究
本研究对恩度促进与肺癌细胞A549共培养体系中的HUVEC凋亡及其机制进行了研究,现报告如下.1 材料与方法1.1 材料购买烟台麦得津生物工程有限公司生产的重组人血管内皮抑制素,购买中国科学院上海细胞库提供的人脐静脉内皮细胞HUVECs、人非小细胞肺癌A549细胞株,购买湖南长沙长锦科技有限公司生产的CO2培养箱,购买杭州四季青公司生产的批号为110213的胎牛血清,购买武汉博士德生物工程有限公司生产的Bax,Bcl-2抗体、链霉素亲和生物素酶复合物(SABC),购买南京凯基生物公司生产的Annexin V2FITC凋亡检测试剂盒,购买日本Olympus IX71倒置荧光显微镜奥林巴斯BX51荧光显微镜,购买新加坡ESCO公司生产的超净工作台,购买GIBCO生产的DMEM与RPMI1640培养基,购买美国Sigma公司生产的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT),购买日本Osaka Takeda公司生产的O-(氯乙酰-氨基酰基)烟曲霉醇(TNP-470),购买美国Moleculor Devices生产的SPECTRAmax190酶联分析仪,Coming Transwll迁移小室直径、孔径分别为6 mm、5μm.
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大蒜素协同紫杉醇对肺癌细胞杀伤作用的实验研究
目的 探讨大蒜素对人肺癌A549细胞周期的影响及其与周期特异性抗癌药物紫杉醇联合使用的抗肿瘤作用.方法 MTT法检测大蒜素对肺癌细胞的增殖抑制作用,流式细胞仪检测细胞周期改变,Annexin V-FITC标记法定量检测细胞凋亡,观察大蒜素与紫杉醇联合使用后药物对细胞毒活性的改变.结果 大蒜素可明显抑制A549细胞生长,72 h药物半数抑制浓度(IC50)为18.55 μg·ml-1;9.30 μg·ml-1大蒜素作用A549细胞24 h后,与对照组比较,G0/G1期细胞的百分率明显减少,而G2/M期明显增加(P＜0.05),大蒜素与紫杉醇联合使用后,紫杉醇72 h IC50值由单独应用的9.21 μg·ml-1下降至1.07 μg·ml-1;细胞凋亡率由53.2%增至97.0%.结论 大蒜素可将肺癌A549细胞阻滞于G2/M期,大蒜素与紫杉醇联合使用可能具有协同抗肿瘤作用.
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基于微流控芯片技术橙皮苷抗肺肿瘤作用机制研究
目的 探究橙皮苷诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用机制.方法 基于微流控芯片技术采用Hoechst 33342/PI染色法检测橙皮苷对肺癌细胞A549凋亡坏死的影响;流式细胞术检测橙皮苷对肺癌细胞周期及凋亡的影响;实时荧光定量PCR技术检测相关基因VEGF、PI3K及PTEN的表达;Western blot 技术检测橙皮苷诱导肺癌细胞中PI3K-Akt信号通路相关蛋白PI3K、Akt、PTEN及凋亡蛋白Bcl-2、周期蛋白Cyclin B1的表达. 结果 橙皮苷作用于细胞G0/G1期及S期,阻滞细胞分裂,并呈现浓度依赖性诱导肺癌细胞凋亡,其细胞凋亡坏死率由正常对照组的(6.7±0.6)%增至(27.9±1.1)%;经橙皮苷诱导后的肺癌细胞中VEGF和PI3K基因表达相对降低,抑癌基因PTEN表达相对增加.Western blot 结果显示,经橙皮苷诱导的肺癌细胞中凋亡蛋白Bcl-2及周期蛋白Cyclin B1相对表达降低,PI3K-Akt信号通路蛋白Akt表达量与对照组比较明显减少,PI3K蛋白表达量相对增加,PTEN表达量无明显变化.结论 橙皮苷可能是通过干扰PI3K-Akt信号通路,阻碍肿瘤细胞的分裂并促进凋亡蛋白的产生,从而诱导肺癌细胞 A549 凋亡.
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罗汉果提取物诱导肺癌细胞 A549凋亡的研究
目的：探讨罗汉果醇诱导肺癌细胞凋亡的作用及可能的分子机制。方法通过分离、纯化得到罗汉果醇单体，以肺癌细胞 A549为对象，采用 MTT 法检测罗汉果醇对肺癌细胞的抑制作用；利用荧光染色、流式细胞仪检测细胞凋亡、细胞周期；以蛋白印迹法检测罗汉果醇对 p21、Bcl-2蛋白表达的影响。结果罗汉果醇能抑制肺癌细胞的增殖，具有促进细胞凋亡、阻滞细胞周期的作用；蛋白印迹检测表明，罗汉果醇可以促进 p21表达升高，Bcl-2表达下降。结论罗汉果醇通过调节 p21、Bcl-2的表达来诱导细胞凋亡和周期阻滞，从而促进肺癌细胞 A549的凋亡。
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LY294002抑制肺癌细胞自噬、增殖、侵袭和迁徙的体外研究
目的 探讨体外LY294002是否通过PI3K/AKT信号通路抑制肺癌细胞自噬、增殖、侵袭和迁徙.方法采用0、10、15、20、25、30μmol·L-1 LY294002(LY294002处理组)作用于人肺癌细胞A549,以PBS替代药物作为对照组.采用CCK8实验检测LY294002处理后A549细胞增殖情况;采用Western blot检测2组A549细胞Beclin-1、LC3B(Ⅱ、Ⅰ)、PI3K、p-AKT及AKT蛋白表达水平;采用Wound healing和Transwell invasion实验检测2组A549细胞迁徙、侵袭情况.结果LY294002能有效抑制A549细胞的增殖,且在24 h呈剂量依赖性,24 h IC50为19.348μmol·L-1.LY294002处理组细胞中Beclin-1、PI3K、p-AKT蛋白表达水平及LC3B(Ⅱ/Ⅰ)比率、细胞迁徙和侵袭力均显著低于对照组(P<0.05).结论LY294002通过抑制PI3K/AKT信号通路降低人A549细胞的自噬活性、增殖、迁徙和侵袭.
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VEGF-C-siRNA对人肺癌细胞A549生物学行为的影响
目的 初步探讨靶向VEGF-C基因的siRNA转染肺癌细胞A549后对其生物学行为的影响.方法 构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒并转染A549细胞,免疫印迹法检测蛋白的表达水平,Transwell小室检测细胞体外侵袭能力,MTT法检测细胞增殖活性.结果 成功构建靶向VEGF-C的siRNA表达质粒.VEGF-C-siRNA转染后的细胞侵袭能力较对照组减弱,生长抑制率明显高于阴性对照组(P＜0.01),且表现出时间依赖性.结论 靶向VEGF-C的siRNA转染后可以显著降低A549细胞侵袭能力,抑制肿瘤细胞增殖.
关键词： VEGF-C-siRNA 肺癌细胞A549 基因沉默 生物学行为 -
荧光素酶标记的肺癌细胞系的建立及动物模型验证
目的 建立一株稳定表达萤火虫荧光素酶的人肺癌细胞系并通过裸鼠成瘤模型进行验证.方法 酶切并连接萤火虫荧光素酶基因到真核表达载体pRc/CMV2上构建pRc/CMV2-1uc重组质粒,脂质体2000转染到肺癌细胞株A549,经G418筛选得到抗性克隆,荧光素酶活性检测筛选出荧光素酶活性高的稳定细胞克隆.小动物活体影像系统检测确定稳定细胞克隆生物发光能力和细胞数量的关系,建立裸鼠皮下成瘤模型并分析移植瘤的发光强度和肿瘤生长的相关性.结果 重组质粒pRc/CMV2-1uc转染A549细胞后,经G418筛选的抗性克隆传代至40代时,确定3株荧光素酶活性较高的阳性克隆,高的9号克隆,1×105个细胞的RLU值为9.44×105.小动物活体影像系统检测发现阳性克隆的发光强度与细胞数量呈正相关(R2=0.99)；9号克隆皮下接种裸鼠形成接种瘤,其发光强度与肿瘤的生长正相关.结论 成功构建了稳定表达萤火虫荧光素酶的A549细胞系,该细胞系可在小鼠活体水平动态监测其发生、发展.
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二冬汤含药血清对肺癌细胞A549的作用研究
目的:研究二冬汤含药血清对肺癌细胞A549的抑制作用、佳给药方案及诱导细胞凋亡.方法:采用MTT法,观察不同给药天数、不同剂量、不同采血时间、不同培养时间的二冬汤血清对肺癌细胞A549的抑制效应,及应用FITC/PI流式细胞术检测佳给药方案含药血清对A549细胞的凋亡率.结果:二冬汤含药血清对人肺癌细胞A549具有抑制作用,中剂量组[7.99g/(kg·d)]给药5天、10天,末次给药2h的含药血清与细胞培养48h后的抑制作用明显,抑制率分别为42.27％和39.67％,与空白血清组比较,差异均有非常显著性意义(P＜0.01);但从给药天数以及与肺癌细胞培养时间上来看,与空白血清组比较,差异无显著性意义(P＞ 0.05);FITC/PI双染法显示二冬汤含药血清对A549的凋亡总计为(28.45±0.68)％,与空白血清组(6.75±0.46)％比较,差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:二冬汤佳给药方案为给药5天,末次给药2h后取血,此时制备的含药血清能诱导细胞发生凋亡.
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虫草素抑制肺癌细胞增殖的体外研究
目的 探究虫草素对肺癌细胞增殖的调节作用及其对细胞相应生理指标的影响.方法 建立肺癌细胞体外培养体系,将生长状态良好的细胞进行分组,并分别与浓度为0、20、40、70、100、1 000 μmol/L的虫草素共培养24h,通过MTT法测定肺癌细胞的增殖率,同时采用一氧化氮(NO)检测试剂盒测定各药物处理组细胞中NO的含量.结果 20μmol/L及其以上浓度的虫草素能显著抑制肺癌细胞的增殖(P＜0.01),显著降低肺癌细胞中NO的相对含量(P＜0.05或0.01),且呈剂量依赖性.结论 虫草素对肺癌细胞的增殖具有显著的抑制效果,且可能通过介导NO相关的信号途径抑制细胞增殖.
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蚓激酶抗肺癌细胞A549增殖作用及其机制
目的 研究蚓激酶对肺癌细胞A549的增殖及细胞周期的影响,初步探讨蚓激酶抗肺癌的作用机制.方法 通过MTT法检测不同浓度的蚓激酶作用于A549细胞24 h后对细胞增殖的影响；通过显微镜观察细胞形态变化；流式细胞仪检测蚓激酶对A549的细胞周期阻滞情况；RT-PCR检测蚓激酶对P53基因表达影响.结果 蚓激酶对A549有明显抑制作用,且抑制作用呈浓度依赖性,其半数抑制浓度(IC50)为(54.35 ±2.112) U/mL;A549经蚓激酶作用后形态变化显著,细胞边缘皱缩,漂浮细胞的数目随着药物浓度的增高而增大；蚓激酶阻滞A549细胞周期于S期；RT-PCR检测表明,蚓激酶能明显上调P53基因的表达.结论 蚓激酶在体外能明显抑制肺癌细胞A549的增殖,并阻滞细胞周期于S期,其机制可能与上调P53基因表达有关.
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PM2.5暴露对肺癌细胞A549自噬和凋亡的影响
目的 研究PM2.5暴露对人肺癌细胞A549的自噬影响探讨自噬与凋亡的关联效应.方法 100μg/mL PM2.5分别处理A549细胞0、2、4、12、24 h,采用免疫荧光观察处理PM2.524 h对细胞自噬的影响,免疫印迹法检测PM2.5对肺癌细胞自噬和凋亡重要基因的表达的影响,运用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-MA)处理细胞进一步明确自噬通路对细胞凋亡的作用.结果 细胞自噬标志物LC3-II蛋白表达均明显著增强,LC3-II/LC3-I比值升高,而凋亡蛋白Bax逐渐下调(均P<0.05);免疫荧光显示,PM2.5组细胞的绿色荧光增强;但运用细胞自噬抑制剂(3-MA)会抑制LC3II/LC3I的转化,促进Bax的表达.结论PM2.5可诱导肺癌细胞保护性自噬的发生,抑制自噬能够促进PM2.5对肺癌细胞的凋亡诱导.
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化州柚花挥发油的GC-MS分析及其对肺癌细胞A549增殖、迁移的影响研究
目的:提取化州柚花挥发油,鉴定其成分,并评价其对肺癌细胞A549增殖、迁移的体外抑制作用.方法:采用水蒸气蒸馏法提取化州柚花挥发油;采用气质联用法(GC-MS)分析其化学组成,以峰面积归一化法计算各组分的相对百分含量;采用MTT法检测其对肺癌细胞A549增殖的抑制作用,计算细胞相对活力和增殖抑制率;采用细胞划痕实验评价其对肺癌细胞A549迁移能力的影响,计算相对迁移面积和迁移抑制率.结果:从100 g化州柚花中提取得到挥发油0.7 g,得率为0.7％.共从中分离得到了46个组分,鉴定了其中35个组分,占总峰面积的96.95％;相对百分含量较高的化合物包括D-柠檬烯(28.43％)、γ-萜品烯(20.74％)、β-月桂烯(11.97％)、芳樟醇(7.41％)等.与空白对照组比较,120 mg/L化州柚花挥发油可显著降低肺癌细胞A549的相对活力(P<0.05),增殖抑制率上升至21.72％;而1、5、10、20、40、60、80、100 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对活力均无显著影响(P>0.05).作用24、48 h时,60、120 mg/L化州柚花挥发油可显著缩小肺癌细胞A549的相对迁移面积(P<0.05),迁移抑制率分别为132.46％、125.08％(24 h)和124.54％、124.66％(48 h);而30 mg/L化州柚花挥发油对肺癌细胞A549的相对迁移面积均无显著影响(P>0.05).结论:GC-MS法可用于鉴定化州柚花挥发油的化学组成.化州柚花挥发油以D-柠檬烯、γ-萜品烯、β-月桂烯等成分为主,对肺癌细胞A549的增殖、迁移能力具有一定的体外抑制作用.
