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乙型肝炎疫苗加强免疫诱导小鼠细胞免疫应答相关因素的研究
目的 探讨现有乙型肝炎(乙肝)疫苗(Hepatitis B Vaccine,HepB)在小鼠(H-2d)加强免疫中,不同免疫剂量、免疫时间及检测时间对细胞免疫检测的影响.方法 采用三种疫苗剂量,两种加强免疫程序免疫BALB/c小鼠,即初次免疫后14d加强免疫和初次免疫后28d加强免疫,分别于加强免疫后7d、14d分离小鼠脾单个核细胞(Mononuclear Cell,MNC),使用酶联免疫斑点实验(Enzyme-linked Immunospot Assay.ELISPOT)测定小鼠MNC的干扰素( Interferon,IFN)-γ、白细胞介素(Interleukin,IL)-2和IL-5斑点形成细胞数(Spots-forming Cell,SFC).结果 加强免疫后7d,IFN-γ和IL-2的分泌均处于较高水平,而加强免疫后14d检测时两者SFC均出现下降；同时14d时可见ELISPOT阳转率也下降,而加强免疫后7d时阳转率均为100％; 14d加强免疫与28d加强免疫程序相比,前者在加强免疫后7d、14d IL-2分泌水平均高于后者,在28d加强免疫后7d检测IL-5阳转率均较高,14d时其阳转率出现下降.结论 HepB在第14d进行加强免疫能够诱导较高的细胞免疫反应,加强免疫后7d可检测到较高的细胞免疫反应.
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化学发光免疫分析法与酶联免疫斑点试验诊断结核病的相关性研究
目的 通过分析化学发光免疫分析法(CLIA)与酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测γ-干扰素(IFN-γ)结果的相关性,探讨CLIA法诊断结核病的可行性.方法 收集2018年8月7日—9月4日北京航天中心医院收治的28例疑诊结核病患者的血液标本,分别采用CLIA法和ELISPOT法对IFN-γ进行测定,同时以结核分枝杆菌(MTB)培养结果 作为参照标准.采用Kappa相关性分析方法对CLIA法与ELISPOT法检测结果进行评价;绘制受试者工作特征曲线(ROC),分析两种方法诊断结核病的敏感度和特异度.结果相关性分析显示,两种方法检测IFN-γ的Kappa值为0.602;CLIA法诊断结核病的ROC曲线下面积(AUC)为0.875〔95％可信区间(95％CI)=0.743～1.007〕,敏感度为100％,特异度为75％;ELISPOT法诊断结核病的AUC为0.750(95％CI=0.481～1.019),敏感度为75％,特异度为75％.结论 CLIA法与ELISPOT法检测IFN-γ的相关性尚可,CLIA法具有结果易于读取、容易进行高通量检测的特点,有一定的临床应用前景.
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酶联免疫斑点试验在类风湿关节炎相关抗原瓜氨酸化研究中的应用价值
为探讨蛋白瓜氨酸化在类风湿关节炎(RA)患者的致病作用,观察环瓜氨酸肽(CCP)抗原对RA患者外周血T淋巴细胞的激活效应,我们选用CCP抗原刺激特异性T淋巴细胞分泌干扰素-γ(IFN-γ)的酶联免疫斑点实验(ELISPOT),分别检测64例RA患者、32例非RA患者及32例健康对照者外周血单个核细胞(PBMC)分泌IFN-γ的斑点形成细胞(SFC)的阳性率及阳性SFC的斑点数,分析3组个体间SFC阳性率、阳性SFC斑点数的差异；另外在64例RA患者中,分析SFC阳性率、阳性SFC斑点数与抗CCP抗体、关节肿痛数、关节破坏数、红细胞沉降率(ESR)、C反应蛋白(CRP)等指标间的相关性.结果显示,在64例RA患者中,SFC阳性率为79.7％,阳性SFC斑点数为189±45,而在16例骨关节炎(OA)患者、16例强直性脊柱炎(AS)患者及32例健康对照者中SFC阳性率、阳性SFC斑点数分别为6.3％、18; 12.5％、23.5;0％、＜6,RA组与非RA组和健康对照组有显著性差异(P＜0.01).此外在抗CCP抗体阳性的RA患者中,上述2项指标也明显高于抗CCP抗体阴性的RA患者(92.86％、224±54; 54.55％、84±25),有显著性差异(P＜0.05).而RA组患者CCP特异性T淋巴细胞增殖反应与病情活动性指标(关节肿痛数、关节破坏数、ESR、CRP)间无显著相关性(P＞0.05).以上结果提示在RA患者的外周血内存在针对CCP抗原的特异性T淋巴细胞的活化和增殖,提示瓜氨酸化蛋白可能作为RA发病的起动抗原发挥致病作用,并在一定易感基因下参与和介导了RA的发病.
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Epidot-酶联免疫斑点检测方法应用于结核诊断的初步评价
目的:初步评价自行研发的结核分枝杆菌抗原特异性γ-干扰素酶联免疫斑点(Epidot-ELISPOT)检测方法应用于结核病诊断的价值.方法:应用自行研发的Epidot-ELISPOT检测方法及进口T-SPOT.TB试剂盒,检测60份结核病例和75份健康人群的外周血结核特异性γ-干扰素释放水平[斑点形成细胞(spot forming cells,SFCs)].结果:ELISPOT方法与T-SPOT.TB检测方法对结核感染人群中的敏感性分别为81.67%、90.00%,特异度分别为94.67%、94.67%,Epidot-ELISPOT的敏感度与T-SPOT.TB比较(χ2=1.313,P=0.252),特异性比较(χ2=0.000,P=1.000),差异均无统计学意义.分别用上述两种方法检测肺结核痰阳组和痰阴组形成的SFCs,组间差异均无统计学意义.结论:自行研发的结核分枝杆菌抗原特异性γ-干扰素酶联免疫斑点技术的灵敏度和特异性与T-SPOT.TB检测方法类似,可用于结核感染的辅助诊断.
关键词： 结核 酶联免疫斑点实验 T-SPOT Epidot-ELISPOT -
结核分枝杆菌Ag85A在毕赤酵母中的表达、纯化及酶联免疫斑点试验研究
目的 利用毕赤酵母表达和纯化结核分枝杆菌Ag85A蛋白,以期得到高效刺激T淋巴记忆细胞产生γ-干扰素的特异性抗原.方法 用PCR扩增得到Ag85a基因,构建出重组质粒pPic9k-85a,通过电转化进入毕赤酵母,经遗传霉素G418抗性筛选、硫酸铵沉淀浓缩及离子交换层析纯化得到目的蛋白.后以大肠杆菌和毕赤酵母表达的Ag85A分别为抗原刺激物进行酶联免疫斑点(Elispot)试验,分析其刺激BCG免疫小鼠T淋巴细胞产生γ-干扰素(IFN-γ)的能力.结果 在毕赤酵母中成功克隆并稳定表达了Ag85A蛋白,Elispot检测结果表明,毕赤酵母比大肠杆菌产生的Ag85A蛋白,对小鼠T淋巴细胞的刺激效果更加明显(P＜0.05),能产生更多的免疫斑点.结论 毕赤酵母表达的Ag85A蛋白可以更高效的刺激T淋巴细胞,可用于检测结核杆菌感染诱导的细胞免疫应答.
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ELISPOT检测在老年肺结核诊断中的应用价值
目的 评价结核分枝杆菌特异性IFN-γ酶联免疫斑点(Elispot)检测技术对老年人肺结核的诊断价值.方法 对46例老年肺结核、85例中青年肺结核、22例老年非肺结核、97例健康对照,进行Elispot检测并分析该技术诊断老年肺结核的可靠性.结果 老年和中青年肺结核Elispot检测的敏感度分别为76.19%和87.5%,特异度分别为84.47%和85.29%.中青年和老年肺结核组Elispot检测阳性率显著高于其它两组(P<0.05).结论 Elispot检测技术在诊断老年肺结核中显示出较好的敏感性和特异性,阳性率高,可用作老年肺结核的辅助诊断.
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ELISPOT检测特异性抗体形成细胞功能
目的:建立一种简便的ELISPOT方法,用于检测和评价特异性抗体形成细胞的功能,并观察HPV16L1蛋白疫苗接种小鼠诱发体液免疫的效应.方法:将HPV16L1抗原或抗鼠IgG的俘获抗体包被在预先贴有硝酸纤维素膜的培养板微孔内,取被HPV16L1蛋白疫苗免疫的鼠脾细胞,经HPV16L1抗原刺激后加到微孔内,已固定的抗原/抗体可与细胞分泌出的抗体结合.再加入RAM-HRP标记的羊抗鼠IgG和沉淀性底物溶液(DAB),可在有HPV16L1特异抗体产生细胞的位置产生棕褐色的斑点,每个斑点代表一个分泌细胞.同时ELISA法检测血清与脾细胞上清液中HPV16L1特异性IgG水平.结果:免疫组HPV16 L1特异性抗体生成细胞的频数明显高于对照组.结论:ELISPOT法较ELISA法更灵敏,HPV16L1疫苗可有效刺激小鼠产生特异性抗体.
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酶联免疫斑点实验与蛋白芯片检测结核分枝杆菌免疫应答的研究
目的:同时检测结核病人的细胞和体液免疫应答,初步探讨结核病人的免疫应答特点.方法:应用自行研制的酶联免疫斑点方法,联合结核分支杆菌蛋白芯片(阿拉伯甘露糖LAM、16 KD蛋白、38 KD蛋白、14 KD蛋白、9.7 KD蛋白和19 KD蛋白六种抗原)检测我市78例结核病患者的标本,进行相关统计学分析.结果:61例芯片阳性反应中,四种抗体阳性者比例高,占34.43％(21/61),其中又以抗LAM+16KD+38KD+ 14KD+反应模式的比例较高.Epidot-ELISPOT在结核芯片各阳性组和结核芯片阴性组形成的SF-Cs中位数无显著性差异.78例结核病患者的Epidot-ELISPOT方法阳性率为62.82％ (49/78),蛋白芯片法阳性率为78.21％ (61/78),一致阳性率为44.87％ (35/78).结论:分泌γ-干扰素的T细胞反应程度与针对6种抗原的不同结核抗体反应模式间并无明显相关性.联合体液和细胞免疫检测可以进一步提高检测灵敏度.
关键词： 结核 酶联免疫斑点实验 Epidot-ELISPOT 蛋白芯片 -
HIV-1附属蛋白特异性细胞毒性T细胞应答研究
人类免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus, HIV)附属蛋白Nef、Vpu、Vpr和Vif 在病毒复制中起着关键作用,并能被细胞毒性T细胞(Cytotoxic T Lymphocyte, CTL)识别.然而,对我国HIV感染者体内附属蛋白特异性的CTL应答研究比较少.本研究应用覆盖HIV-1B、C亚型附属蛋白(Nef、Vpu、Vpr和Vif)的142个肽段作为抗原,通过酶联免疫斑点实验(Enzyme-Linked Immunospot,ELISPOT)检测61例中国HIV/AIDS患者和10例HIV-1血清阴性对照的HIV-1附属蛋白特异性CTL应答.无论对HIV-1B 亚型还是HIV-1C亚型附属蛋白都能产生特异性CTL 应答,特别是Nef区蛋白的反应频率和累积应答强度都较高(P＜0.001),B、C亚型间的应答频率和累积应答强度都无显著差别(P＞0.05),其免疫优势区也大致相同.附属蛋白特异性的累积CTL应答强度将近达到总应答的21%.这些结果表明尽管HIV-1附属蛋白的体积小,但它们在诱导特异性的CTL应答中发挥了重要作用,对评价HIV-1免疫应答的幅度和特异性以及研发针对中国人群的HIV疫苗有重要的意义.
关键词： 人类免疫缺陷病毒1型 细胞毒性T细胞 酶联免疫斑点实验
