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低氧促进兔骨髓间充质干细胞增殖
目的 观察低氧/常氧间传代培养对兔骨髓间充质干细胞(rMSCs)增殖的影响.方法 将在5%O2下扩增的细胞接种后,或继续在5%O2下培养,记为L-L;在20%O2下培养,记为L-N;对20%O2下扩增的细胞作同样的处理,分别记为N-N和N-L.取各组细胞进行生长曲线、集落形成率、葡萄糖乳酸代谢和胞内ROS的测定.结果 L-L组的细胞数和集落形成率高,N-N组低,而胞内ROS的水平则与此相反.低氧下培养的MSCs葡萄糖比消耗速率和乳酸比生成速率较高,乳酸对葡萄糖的得率大于2.0 mmol/mmol.结论 持续低氧传代培养促进rMSCs的增殖;低氧对MSCs增殖的影响与胞内ROS的表达密切相关.
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骨髓间充质干细胞复合海螵蛸支架的部分生物学安全性评估
制作与鉴定自体兔骨髓间充质干细胞-海螵蛸复合支架,进行生物学安全性评估.采用密度梯度离心联合贴壁筛选法,体外培养兔骨髓间充质干细胞(BMSCs);采用沉淀法,构建BMSCs-海螵蛸复合支架;通过电镜扫描及MTT试验,对复合支架进行检测.选取40只新西兰兔,分两组分别植入BMSCs-海螵蛸复合支架(试验组)或海螵蛸支架(对照组),通过肌肉植入试验评估复合支架的生物学安全性.密度梯度离心联合贴壁筛选分离培养出于细胞,其免疫细胞化学检测表面抗原CD29(+).电镜扫描测得海螵蛸支架孔隙率为81.730％±6.770％.扫描电镜下见细胞黏附于海螵蛸支架爬行生长,分泌胞间基质.MTT检测:复合培养第1、3、5、7天之间吸光值两两比较,均有显著性差异(P＜0.05),细胞呈逐渐增殖趋势;第7、8天比较无显著差异,表明第8天细胞无明显增殖.肌肉植入试验的血常规、血生化检测,复合支架组(试验组)与海螵蛸组(对照组)检测结果无显著差异,复合支架的各项指标达标.病理切片:第7天,试验组与对照组的组织炎症反应为Ⅲ ～ Ⅳ级;第14天,二者的组织炎症反应为Ⅱ ～ Ⅲ级;第28天,二者的组织炎症反应为Ⅰ～ Ⅱ级;第56天,二者的组织炎症反应为0～Ⅰ级:均符合肌肉植入试验结果评定标准.自体BMSCs能与中药海螵蛸联合培养构建复合支架,支架上的细胞数量随培养时间延长而增多,第7天时达增殖高峰.研究表明,此复合支架的组织相容性良好,符合生物材料的应用要求.
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纳米β-磷酸三钙/胶原复合兔骨髓间充质干细胞修复兔颌骨缺损的实验研究
目的:探讨新型纳米β-磷酸三钙/股原支架材料与兔自体骨髓间充质干细胞联合修复兔颌骨缺损的效果.方法:取兔红骨髓,采用全骨髓培养法,获得骨髓间充质干细胞,体外确定其成骨分化能力.与支架材料体外复合后回植入下颌骨10mm×8mm大小箱状骨缺损腔内.10w取材,组织切片观察成骨情况.结果:获得大量增生活跃3-4代兔骨髓间充质细胞,经体外鉴定可向成骨方向分化.与纳米β-磷酸三钙/胶原复合后体内成骨效果优于单纯纳米β-磷酸三钙/胶原.结论:兔BMSCs与Nβ-TCP/Co结合后回植入兔颌骨人工骨缺损区后,可以良好成骨,成骨较单纯纳米β-磷酸三钙/胶原复合体好.
关键词： 兔骨髓间充质干细胞 纳米β-磷酸三钙/胶原 颌骨骨缺损 -
胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶及用于兔骨髓间充质干细胞的三维培养
目的 构建一种模拟细胞外基质的胶原模拟多肽-聚乙二醇(PEG)杂化水凝胶并应用于兔骨髓间充质干细胞(rBMSCs)的三维(3D)培养.方法 利用胶原模拟多肽末端的半胱氨酸与马来酰亚胺修饰的多臂PEG偶联形成杂化水凝胶,圆二色谱表征胶原模拟多肽的三螺旋结构及其热稳定性,流变学检测和扫描电镜观察研究杂化水凝胶的成胶过程、机械强度及水凝胶内部结构.将rBMSCs包埋于杂化水凝胶中进行3D培养,检测水凝胶的细胞相容性及其对rBMSCs分化的影响.结果 胶原模拟多肽能自发形成天然胶原的三螺旋结构,其热变性温度为49.4℃.胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶成胶迅速,内部呈现多孔的网络状纤维结构;杂化水凝胶3D培养rBMSCs 24 h后,绝大部分细胞保持存活状态,基因表达分析结果显示该水凝胶体系构建的3D培养环境能影响rBMSCs的分化.结论 胶原模拟多肽-PEG杂化水凝胶制备条件温和,具有良好的机械强度和细胞相容性,有利于rBMSCs的软骨分化.
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独正岗接骨膏对体外培养兔骨髓间充质干细胞成骨活性的影响
目的 观察独正岗接骨膏对骨髓间充质干细胞(BMSCs)成骨活性的影响.方法 分离、培养兔骨髓间充质干细胞,选取生长良好第3代BMSCs分组培养.依据培养基中加入影响因子的不同分为4组:对照组,不加任何影响因子;独正岗接骨膏组,分别加入三种不同浓度独正岗接骨膏水提液(5％、10％、20％);Chordin干预组,分别于三种不同浓度独正岗接骨膏水提液(5％、10％、20％)中均加入Chordin(100μg/L)进行干预;Noggin干预组,分别于三种不同浓度独正岗接骨膏水提液(5％、10％、20％)中加入Noggin(100μg/L)进行干预.各组分别于培养第4、7、10天进行指标检测.采用MTT法测定各组BMSCs细胞相对数量;采用磷酸苯二钠法测定各组细胞ALP活性;采用Real-time PCR法检测各组细胞中BMP-2,7,9基因的表达情况.结果 加药干预4、7 d后,与对照组相比,各组细胞均有明显增殖趋势(P<0.05),其中各组内10％ 浓度细胞增殖趋势显著高于同期5％、20％ 浓度(P<0.05),20％ 浓度细胞增殖趋势高于同组5％ 浓度(P<0.05);加药干预10 d后,各组细胞增殖趋势低于对照组(P<0.05);加药干预4、7、10 d后,除对照组外,各组细胞ALP活性、BMP-2,7,9基因表达量均在7 d时达到高,随后开始下降(P<0.05);各组间比较,在各时间段(4、7、10 d),独正岗接骨膏组ALP活性、BMP-2,7,9基因表达量均高于同期Chordin干预组和Noggin干预组(P<0.05);结论 独正岗接骨膏可能通过促进BMP的早期表达,促进BMSCs向OB分化,达到促进骨折愈合的作用.
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骨形态发生蛋白2基因转染的兔骨髓间充质干细胞复合聚乳酸-聚己内酯支架体外构建载基因仿生骨的实验研究
[目的] 构建聚乳酸-聚己内酯(PLA/PCL)吸附骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein-2,BMP-2)基因的聚乙二醇(PEG)纳米复合物形成生物可降解仿生骨材料,接种兔骨髓间充质干细胞(rabbit bone mes-enchymal stem cells,rBMSCs),检测BMP-2基因的转染情况及其对细胞增殖、分化的影响.[方法] 通过溶液共混法制备PLA/PCL载基因仿生骨,接种rBMSCs细胞于仿生骨之上,培养48 h；Real-time PCR检测转染后细胞BMP-2及骨钙素mRNA表达水平；应用Western Blot及免疫组化检测rBMSCs转染后BMP-2蛋白表达；免疫荧光检测rBMSCs细胞Ⅰ型胶原蛋白表达；ELISA检测转染后细胞培养上清中分泌BMP-2浓度,同时检测细胞内碱性磷酸酶活性,从而分析细胞分化情况；流式细胞检测转染BMP-2后细胞周期的变化.[结果] 以未转染细胞作为对照,免疫组化表明转染后细胞内BMP-2表达量明显上调(P＜0.05)；Real-time PCR检测结果表明BMP-2与骨钙素mR-NA表达显著增加(P＜0.05)；同时Western Blot结果同免疫组化结果相似,BMP-2也有明显上调(P＜0.01)；免疫荧光检测Ⅰ型胶原表达量显著上升(P＜0.01)；ELISA检测细胞培养上清中BMP-2分泌量也有增加(P＜0.05)；碱性磷酸酶较对照组相比活性显著增强(P＜0.05),而流式细胞检测S期细胞无明显变化(P＞0.05).[结论] 载基因仿生骨具有稳定而安全的转染性能,其转染后对rBMSCs细胞的分化效果是明显的,而对于细胞周期变化的影响并不显著.
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全骨髓贴壁法获取组织工程髓核种子细胞的相关研究
目的 明确兔骨髓间充质干细胞的分化能力及分化条件,以TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞向类髓核细胞分化,为组织工程髓核的构建提供良好的种子细胞.方法 利用全骨髓贴壁法分离获取兔骨髓间充质干细胞,并对细胞进行培养和传代,以特定的环境及细胞诱导液进行诱导,促使其向特定的中胚层细胞分化.再将细胞分为四组,A:空白对照组,B:BMP-7诱导组,C:TGF-β3诱导组,D:TGF-p3与BMP-7共同诱导组,诱导21天后对蛋白聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原和SOX9基因进行realtime-PCR检测.结果 全骨髓贴壁法分离获得的原代兔骨髓间充质干细胞生长良好,2周后显微镜下观察细胞间形态较为一致,成纺锤形.细胞传代后生长良好.细胞表面表达CD29、CD105、CD166表面标记物.在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,培养21天后,通过特定染色发现兔骨髓间充质干细胞向预定方向分化生长.以TGF-β3和BMP-7生长因子诱导21天后,蛋白聚糖、Ⅱ型胶原和SOX9基因表达C组和D组明显高于A组和B组(P＜0.05),Ⅹ型胶原表达A组和B组明显高于C组和D组(P＜0.05),Ⅰ型胶原表达四组之间无明显差异.结论 全骨髓贴壁法可以成功分离获得状态良好的兔骨髓间充质干细胞,在成骨诱导培养液、成软骨诱导培养液和脂肪诱导培养液的诱导下,兔骨髓间充质干细胞可向预定的方向分化且生长良好.TGF-β3和BMP-7诱导兔骨髓间充质干细胞后可明显提高其类髓核细胞具有的下游基因表达水平.
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MRI体外定量测定SPIO标记兔骨髓间充质干细胞
目的 测定MRI监测SPIO标记兔骨髓间充质干细胞(r-MSC)的低SPIO浓度,寻找MRI体外定量测定SPIO标记r-MSC的方法.方法 分离、培养r-MSC,不同浓度SPIO标记r-MSC 24 h后采用3.0 T MRI T2*W-GRE、T1W-GRE、T2W-PROPELLER序列扫描标本.结果 3种序列中,T2 * W-GRE序列体外监测SPIO标记干细胞的能力佳,1×105/ml、1 × 106/ml细胞浓度下,T2 *W-GRE序列测定的平均MR信号衰减率(△SI)与SPIO浓度之间具有强相关.结论 适宜细胞浓度下,T2 * W-GRE序列可用于定量近似预测SPIO标记浓度.
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兔骨髓间充质干细胞在兔角膜缘干细胞完全缺乏模型眼表的分化
目的 探讨兔骨髓间充质干细胞(BMSC)移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后是否能分化成角膜上皮细胞.方法 3～5月龄清洁级日本大耳白兔24只,采用全周角膜缘板层切除术加中央角膜上皮刮除术建立兔右眼角膜缘干细胞完全缺乏模型,4周后观察眼表形态,行苏木素-伊红(HE)染色、过碘酸-雪夫(PAS)染色及DAPI染色鉴定模型成功与否,选取成功模型18只(36只眼),应用随机数字表法分为对照组(18只兔左眼)、模型组、羊膜组、羊膜加BMSC组,后3组每组6只(兔右眼).取第三代(P3)兔BMSC,以去上皮羊膜为载体培养观察,待细胞铺满羊膜达90％以上时进行移植手术,于移植术后12周观察兔右眼表形态,行HE染色观察角膜结构,免疫荧光检测兔BMSC分化方向.结果 建模后4周有21只兔右眼眼表形态评分达到7分及7分以上,行HE染色、PAS染色、DAPI染色,结果显示角膜缘及角膜上皮细胞层被清除,浅基质层大量炎症细胞浸润及新生血管形成,可见杯状细胞形成,说明模型构建成功.移植术后12周照相观察眼表形态,与自身兔左眼角膜相比,模型组兔右眼角膜混浊,有大量新生血管,羊膜组右眼角膜轻度混浊,有少量新生血管,羊膜加BMSC组兔右眼角膜透明,未见新生血管;HE染色显示羊膜加BMSC组角膜结构修复完整,免疫荧光检测到羊膜加BMSC组有角膜分化的特异性标记因子CK3+ 12表达,而羊膜组未见表达.结论 兔BMSC移植到兔角膜缘干细胞完全缺乏模型后,在体内能够分化成角膜上皮细胞或角膜样上皮细胞,恢复眼表结构及功能.
关键词： 兔骨髓间充质干细胞 兔角膜缘干细胞完全缺乏模型 角膜上皮细胞 移植 分化 -
兔骨髓间充质干细胞联合无机诱导因子支架修复兔胫骨缺损实验研究
目的 对兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)联合无机诱导因子支架修复兔胫骨缺损进行分析研究.方法 将36只新西兰大白兔随机分为三组,A组(空白组),B组(对照组)、C组(实验组),各12只.在兔双侧胫骨制备直径为6 mm的骨缺损区域.A组不做任何处理,B组单纯植入支架,C组植入支架与细胞的复合物.分别于4 w、8 w、12 w、16 w行一般情况、X线及骨密度检查.结果 术后各组进食均正常,切口愈合良好.术后A组第12 w无修复迹象;B组第4 w、8 w骨缺损部分修复,12 w骨缺损完全修复;C组各时间点骨缺损修复和骨痂生长情况显著优于B组;C组术后4 w、8 w、12 w时各缺损区的骨密度显著高于B组,差异有统计学意义(P<0.05);两组16 w骨密度比较无明显差异,差异无统计学意义(P>0.05).X线显示,B组术后12 w缺损区基本修复.C组术后4 w缺损区可见骨痂生长,8 w骨缺损基本修复.结论 兔骨髓间充质干细胞联合无机诱导因子支架体外复合培养构建组织工程骨修复骨缺损的能力较单纯植入支架强且迅速.
