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前列腺癌患者抗体库构建中抗体基因的扩增
目的:探讨如何扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础.方法:分离前列腺癌患者外周血淋巴细胞,提取其总RNA,逆转录为cDNA,通过改变PCR反应条件扩增出全部κ、λ轻链及大部分重链Fd段;改变PCR反应条件扩增未成功的重链片段改用半套式PCR进行扩增.结果:不仅所有引物都扩增出产物,而且其产量也较高.结论:这表明改变PCR反应条件与半套式PCR联合应用可扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础.
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大容量天然人源单链抗体库的构建及抗乙型肝炎病毒PreS1单链抗体的淘选
目的:从大容量抗体库中淘选全人源化抗乙型肝炎病毒PreS1的单链抗体.方法:以60例健康供者的外周血淋巴细胞为来源,构建了1010人源天然单链抗体库,并以PreS1抗原肽进行淘选.3轮淘选后,单克隆经ELISA检测,富集的特异性单克隆经E.coli HB2151表达后进行Western检测并测序.结果:3轮淘选之后,噬菌体的投入/产出比提高了100倍.抗原抗体反应结果显示,A410=1.0的抗PreS1的单链抗体得到富集.Western结果显示其插入的单链抗体片段正确.该抗体基因序列的DNAPLOT软件分析结果进一步表明该抗体是人抗体,其VH属于VH1亚族,Vλ属于Vλ1亚族.结论:这一技术是获得全人源化抗PreS1的单链抗体的有效途径,同时为基因工程抗体用于临床治疗乙型肝炎奠定基础.
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人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库的构建及筛选
目的 构建人源抗狂犬病病毒单链抗体(Single-chain fragment variable,scFv)噬菌体抗体库,并进行筛选.方法 以接种过狂犬病疫苗的21份高效价的健康人外周血为原料,提取淋巴细胞总RNA,PCR扩增VH、Vκ、Vλ基因,重叠延伸PCR扩增获得scFv基因,克隆入噬菌粒pS100,电转化E.coli TG1,建立scFv初级抗体库,并进行基因序列分析及鉴定.以灭活的狂犬病病毒为抗原,进行3轮scFv噬菌体抗体库的富集筛选,随机挑取单克隆,制备噬菌体抗体颗粒,并进行ELISA分析,阳性克隆进行序列分析,采用快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent facus inhibition test,RFFIT)检测噬菌体抗体颗粒的中和活性.结果 获得了库容为1.7×108的人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,该抗体库具有较好的序列正确率和多样性,经3轮筛选后,ELISA分析显示,共获得24个序列各不相同的针对狂犬病病毒的阳性克隆,对其中7个克隆的噬菌体抗体颗粒进行RFFIT检测,均具有中和活性.结论 已成功构建了人源抗狂犬病病毒scFv噬菌体抗体库,并建立了筛选方法.
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大容量人源天然噬菌体抗体库的构建
目的 构建大容量(＞108)的人源天然噬菌体抗体库.方法 提取人外周血淋巴细胞mRNA,反转录出cDNA第一链,以此为模板,PCR扩增重链(VH)和轻链(VL)基因片段.将VL基因PCR产物插入含Loxp和Loxp511序列的pDF载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建轻链库,再将VH基因PCR产物插入轻链库载体中,电转化大肠杆菌XL1-Blue,构建初级库.进一步用初级库超感染BS1365菌,使其VH与VL发生重组,获得重组库,再利用重组库感染大肠杆菌XLI-Blue,构建工作库.结果 所有VH和VL亚类基因的扩增产物片段大小均与理论值相符,轻重链基因的克隆效率均为100%.初级库容量为108,滴度为6×1013;重组后的工作库有效容量为8×1010滴度至少为1×1013.结论 已构建容量为1010的人源天然噬菌体抗体库.
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人源核糖体展示单链抗体库的构建
目的 构建人源核糖体展示单链抗体(scFV)库.方法 从人外周血单个核细胞中提取总RNA,反转录为cDNA,以此为模板,设计多对具有简并性特点的引物,PCR扩增人免疫球蛋白重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因,在其两端加上核糖体展示所需元件,并通过重叠PCR法将VH和vL经(Gly4Ser)3短肽连接成单链抗体,构建核糖体展示库.结果 利用不同引物进行PCR时,绝大多数引物能扩增出300～400 bp的VH和VL片段;通过大引物扩增成功加上了核糖体展示所需元件,重叠PCR体外连接成约900 bp大小的scFv基因,大量扩增得到核糖体展示库.结论 已成功构建了人源核糖体展示scFv库,为人源抗体药物的开发奠定了基础.
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全人源单链抗体库噬菌体展示技术的建立
目的 建立全人源单链抗体(single-chain antibody fragment,scFv)库的噬菌体展示技术.方法 采集100名健康老年志愿者的外周血,5 mL/人,混合所有全血并分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),抽提RNA,反转录合成cDNA,以其为模板,IgG类抗体基因为引物,PCR扩增获得重链可变区片段(VH)和轻链可变区片段(VL),然后以VH和VL为模板,经重叠PCR获得scFv,经sfi Ⅰ酶切,插入pComb3xss载体,电转后获得一定容量的抗体库;加入辅助噬菌体VCSM 13过夜培养,上清液经PEG-NaC1沉淀,无菌PBS重悬噬菌体沉淀,即完成噬菌体抗体库的构建;采用Phage ELISA法进行噬菌体单克隆抗体的特异性鉴定.结果 成功构建了库容为2.6× 109的噬菌体抗体库;随机挑选的100个噬菌体单克隆中共筛选到2个疑似H1N1株HA抗原的噬菌体抗体.结论 成功构建了噬菌体抗体库的技术平台,可用于各类功能抗体的筛选.
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噬菌体展示抗体库技术的研究进展
噬菌体展示抗体库技术是一种将抗体组合文库与噬菌体表面展示技术相结合所形成的新技术,可以将抗体分子展示在噬菌体表面,且保持了抗体的天然构象和生物学活性,为人源抗体的制备提供了良好的技术平台.本文对噬菌体展示抗体库技术的原理、特点、类型及其研究进展作一综述.
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构建大容量噬菌体抗体库及获得人源抗体的策略
构建大容量噬菌体抗体库,可实现不经免疫直接制备针对任意抗原的人源性抗体.本文综述了噬菌体抗体库技术的原理、抗体库的构建方法、不经免疫制备人源抗体的策略以及提高抗体体外亲和力的方法.
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噬菌体抗体库筛选技术
在过去的20年中,噬菌体抗体库筛选技术被广泛的应用于抗体筛选、疾病治疗,临床诊断以及基础研究之中.在该技术的应用过程中,快速有效的筛选出适合的单克隆抗体并进行可靠和高效的数据管理和分析是十分重要的.文中总结了近年来噬菌体抗体库的高通量筛选方法并且对数据管理做了简要介绍.
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噬菌体表面呈现技术及在疫苗研制中的应用
噬菌体表呈现展示技术(Phage Display Techniques,PDT)是将编码外源肽或抗体可变区的DNA片段插入噬菌体表面特定蛋白基因中,以融合形式与噬菌体的表面蛋白共同表达于噬菌体表面的技术,它将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起,是一种高效的筛选系统,因而在抗原表位的模拟、蛋白质工程的改造、单克隆抗体的制备、药物筛选及疫苗研制等方面,具有广泛的用途.
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结肠癌患者淋巴结构建抗结肠癌噬菌体Fab抗体库
目的构建2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库.方法取2个结肠癌患者转移淋巴结,提取淋巴结总RNA,逆转录PCR扩增重链Fd和κ轻链cDNA.依次将PCR产物插入载体pComb3的相应部位,噬菌体VCSM13辅助感染.以点印迹检测噬菌体表面Fab的表达.结果所选2种Ig亚类的重链Fd片段、2种κ轻链cDNA得到扩增.Fd片段和κ轻链均插入pComb3的重组率为40%,Fab噬菌体表达库容量达1.48×106.噬菌体悬液的点印迹免疫染色显示有Fab表达.结论构建了2个结肠癌患者自然致敏淋巴结抗体Fab段噬菌体呈现库,为筛选结肠癌相关抗体奠定了基础.
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人源肺腺癌噬菌体抗体库的构建及筛选
目的:构建人源噬菌体单链抗体ScFv基因文库,并从中筛选出抗肺癌抗体.方法:提取肺癌患者癌旁淋巴结组织,通过RT-PCR扩增出重链可变区基因(VH)和轻链可变区基因(VL),再经剪切-重叠-延伸PCR(SOE-PCR)将VH 和VL连接得到单链抗体ScFv.将双酶切后的ScFv基因片段克隆入噬菌体表达载体pCANTAB5E,得到初级噬菌体抗体库.以肺腺癌细胞株A549为抗原对抗体库进行"吸附-洗脱-扩增"筛选富集,共进行4轮筛选,鉴定抗体库性能.结果:成功构建噬菌体单链抗体库.在亲和筛选过程中,肺癌单链抗体得到富集,收获率逐轮提高,第4轮为第1轮的115倍.随机选取10个克隆,通过ELISA法检测到其中7个与肺癌细胞呈阳性反应,阳性率为70%.结论:通过噬菌体展示技术得到肺癌相关人源单链抗体,筛选后的单链抗体能与肺腺癌细胞A549特异性结合.
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抗体药物研究进展
抗体作为药物用于疾病治疗已有很长历史,其间曾几经周折,但随着抗体立体结构的阐明和分子生物学技术的发展,人们可以利用DNA重组技术进行鼠抗体人源化改造、构建合成或半合成抗体库及噬菌体抗体库,从中获得人源抗体,甚至利用转基因小鼠获得人源抗体.同时人们也可以利用分子生物学技术改良抗体性能,使之有效地到达靶部位,或提高抗体的亲和力,或提高抗体的效应功能.因此,在对疾病发生机制进一步了解的基础上,治疗性抗体前景看好,它们将在人类疾病的治疗中发挥重要作用.
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噬菌体抗体库筛选技术
噬菌体抗体库技术,能够绕过免疫动物和细胞融合等过程制备单克隆抗体,并能通过在原核细胞体系中抗体片段的克隆选择,分离得到几乎所有抗原的人源性抗体[1].因此,已成为生命科学研究的突破性进展之一.
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两种菌落聚合酶链反应在抗体库筛选中的应用比较
目的:探讨两种菌落PCR方法在抗体库筛选中的应用价值. 方法:分别以5个阳性克隆细菌菌落直接悬浮于去离子水中及悬浮于含0.1%的Triton X-100后经水浴煮沸作为模板,进行PCR反应.同时提取质粒DNA,进行双酶切鉴定. 结果:5个克隆的菌落PCR及酶切鉴定均检测到目的基因. 结论:菌落PCR可用于筛选阳性重组克隆.菌落直接加入去离子水中作为模板进行PCR反应的方法可在大规模阳性重组DNA的筛选鉴定中推广应用.
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人源性抗体库技术及其应用前景
抗体是机体免疫系统的重要效应分子.抗体制备经历了多克隆抗体(PcAb)、单克隆抗体(McAb)、和基因工程抗体的过程.抗体库技术的问世,加速了人源化抗体的开发,生产了大量用于研究、更适于体内诊断和治疗的基因工程抗体[1].抗体药物已成为生物制品类药物的重要部分,截止2004年底,经美国食品药品管理局(FDA)批准的抗体药物已有近20种,其中80%是基因重组抗体,目前正在进行临床验证的抗体药物也有数百种.重组人源性抗体作为药物具有广阔的应用前景.
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噬菌体展示抗体库技术及其应用
噬菌体抗体库技术的出现为人源性抗体的制备提供了良好的技术平台,并且逐渐成为目前获得人源性抗体的主要手段之一.噬菌体抗体库技术是20世纪90年代初期抗体工程领域的一项重大进展,它是噬菌体展示和抗体文库两种技术的集成,目前广泛应用于生物医学领域.此文对该技术的构建、亲和筛选方法及其应用价值进行了综述.
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抗血小板人源噬菌体抗体库的构建和初步筛选
目的运用噬菌体抗体库技术构建一个经血小板自身免疫的抗体组合文库.方法从3例慢性特发性血小板减少性紫癜(ITP)患者的外周血中分离淋巴细胞,提取总RNA,经逆转录合成cDNA,通过半巢式PCR扩增抗体轻链κ链基因和重链Fd段基因,并依次克隆到载体pComb3中构建人源噬菌体Fab抗体库.结果 20次电转后得到库容约为2.3×106 cfu的人源噬菌体Fab抗体库.用多聚甲醛固定的血小板细胞作为抗原,通过3轮亲和选择,ELISA鉴定结合活性较高者,选取3个经测序分析后显示抗体轻链和重链Fd段在核苷酸和氨基酸水平都符合人免疫球蛋白基因结构特征.结论成功构建了抗血小板人源噬菌体抗体库,可用于进一步筛选针对血小板特异性靶点如GPIIb/IIIa等的人源抗体,进行以GPIIb/IIIa受体等作为靶点的治疗性人源抗体的研究和开发.
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CA50靶向抗体文库的构建筛选及应用评价
目的 获得针对CA50靶点的高亲和力、高特异性抗体,建立体外诊断CA50检测试剂盒,提高肿瘤诊断的特异性和灵敏度.方法 PCR技术获得单链抗体(ScFv)基因并克隆入pcomb3XSS噬粒载体,通过电转化获得ScFv噬菌体抗体库.用CA50特性识别表位LST a(唾液酸化-乳糖-N-四糖a)的抗原淘洗筛选,获得针对CA50靶点的特异性抗体基因序列.随机挑选克隆测序,验证ScFv抗体库的多样性.利用重叠PCR技术获得人鼠嵌合抗体基因,经过抗体表达纯化及配对筛选建立双抗体夹心法CA50检测试剂盒.同时收集临床诊断阳性样本54例和临床阴性对照样本146例,利用该研究建立的CA50检测试剂盒与罗氏CA50试剂盒进行平行对照,评价其检测相关性.结果 建立噬菌体抗体库的容量为2.5×108,具有较好的多样性.24个PCR鉴定阳性克隆测序,结果为20个正确插入且插入序列均不相同.经过3轮淘洗筛选出5个阳性克隆,经过抗体配对筛选建立的CA50试剂盒临床样本检测结果与罗氏的临床相关性(r=0.98).结论 通过噬菌体展示抗体库技术成功筛选出了针对CA50的高特异性、高亲和力抗体,为CA50检测在相关肿瘤辅助诊断中的应用提供可能性.
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采用抗体库技术筛选抑制肺癌的功能性抗体
目的 研制抑制肺癌细胞功能性单抗,为治疗肺癌提供靶向治疗剂,并为分离获得肺癌相关的分子靶标打下基础.方法 从新鲜人肺癌组织分离肿瘤细胞免疫Bal b/c小鼠,免疫小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合后接种于甲基纤维素,制备大容量功能性抗体库.采用活细胞荧光、ELISA、免疫组化、肿瘤增殖、侵袭、黏附、动物体内治疗实验等方法筛选鉴定抑制肿瘤细胞的功能性单抗.结果 本次融合共获得了1573株杂交瘤克隆,在能与肺癌细胞膜反应的314株克隆中,154株与正常肺组织不反应或低反应.功能性筛选发现41株单抗显著地抑制肺癌细胞增殖,24株能抑制肺癌细胞对Matrigel的侵袭,15株能抑制肺癌细胞与Collagen I的黏附,进一步实验验证了2株单抗能在体内抑制肺癌移植瘤的生长.结论 采用大容量功能性抗体库技术成功获得了多株具有抑制肺癌细胞恶性生物学行为的功能性单抗,其中2株可能具有靶向治疗肺癌的应用潜力.
