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BSA-Y-DOTA免疫噬菌体Fab抗体库的构建及鉴定
目的:构建钇-十二烷四乙酸(Y-DOTA)免疫噬菌体Fab抗体库.方法:将牛血清白蛋白(BSA)与DOTA交联,并与金属Y鳌合制备成BSA-Y-DOTA,用其免疫BALB/c小鼠.检测抗血清的滴度后,分离抗体阳性的小鼠脾淋巴细胞,提取总RNA.利用RT-PCR扩增全套重链Fd和轻链基因,依次插入经改造的噬菌体载体pComb3M的相应酶切位点,构建成Fab噬菌体抗体库.用酶切、序列测定及ELISA等方法,对重组率、多样性及Fab的展示情况进行鉴定.结果:成功得制备了BSA-Y-DOTA交联物,并获得较好的免疫效果.免疫小鼠的全套重链Fd片段和轻链均得到正确扩增;d片断和轻链基因均插入到载体pComb3M中;ab抗体库的库容量达8×107;重组率约为90%,且具有良好的抗体基因多样性.另外,Fab片段也被展示于噬菌体表面.结论:成功地构建了半抗原Y-DOTA的Fab噬菌体抗体库,为筛选Y-DOTA特异性抗体奠定了基础.
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抗戊型肝炎病毒噬菌体抗体库的构建与筛选
目的:构建人抗戊型肝炎病毒 (HEV) 噬菌体抗体库,筛选人源中和性抗HEV的单克隆抗体(mAb) .方法:取抗HEV抗体阳性的6例HE患者静脉血,分离淋巴细胞,提取细胞总RNA后逆转录.用一组人IgG Fab基因特异性引物,分别扩增IgG κ0轻链与重链Fd 段基因.将κ轻链与Fd段基因先后克隆入噬菌体载体pComb3的相应位点,经电穿孔法转化大肠杆菌XL1-Blue,再以辅助噬菌体VCSM13超感染,构建人抗HEV噬菌体抗体库.采用独特的5轮筛选法(逐渐降低抗原包被量,严格洗脱条件),以固相化的4种含中和抗原表位的HEV 代表株ORF2重组混合抗原,筛选人噬菌体抗体库,并以 ELISA鉴定噬菌体抗体.结果:经数次电转化构建了容量为1.9×107重组率为80%的κ轻链基因库;容量为1.8×107重组率为20%的Fab基因库.以含中和抗原表位的HEV代表株ORF2重组混合抗原特异淘筛5次,出现特异富集.ELISA鉴定第5轮筛选产物,得到4株与HEV ORF2重组混合抗原具有较高亲和力的Fab噬菌体抗体,可能为中和抗体.结论:成功地构建了人抗HEV噬菌体抗体库,并获得人源抗HEV特异性噬菌体抗体.
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人源性天然抗体库的构建及初步鉴定
目的构建较大容量的人源性天然抗体库.方法以未经免疫的健康人外周血单个核细胞为基因来源,扩增多样性的κ轻链基因和IgG/IgM重链Fd段基因,分别构建轻链库和重链库,然后组合为Fab段表面展示的噬菌体抗体库.通过多次重组积累达到理想的库容,对抗体库进行筛选和鉴定.结果经过5次轻、重链基因的重组和转化,获得了库容为1×109的人源性天然抗体库.该抗体库性能良好,用3种抗原进行"亲和吸附-洗脱-扩增"淘筛,获得针对其中两种抗原的7株特异性噬菌体抗体.结论天然抗体库为用于不经免疫制备人源性单克隆抗体创造了良好的条件.
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人噬菌体抗体库中异常重组子的分析
目的阐明在噬菌体抗体库技术中,选择适当限制性内切酶酶切位点的重要性,并介绍人抗体可变区胚系基因的限制酶谱.方法从正常人外周血提取淋巴细胞总RNA,用RT-PCR 扩增IgM和IgG1的Fd片段及κ链基因,重组到载体p3MH中构建噬菌体抗体库.以限制性内切酶消化及电泳分析所获重组克隆;用PCGENE软件分析人抗体可变区胚系基因的限制性内切酶谱.结果在构建抗体库的过程中,发现高频率的异常重组子克隆.经序列分析证实,在人VH 基因片段中,存在用于克隆轻链的Sac I位点.对人全部功能性可变区胚系基因进行限制性内切酶谱分析,发现人VH 第Ⅳ家族的11个成员均含有Sac I位点,其它限制酶切位点在抗体可变区胚系基因中具有不同的出现率.结论构建抗体库时,用于重组可变区基因的酶切位点,对库的构建具有重要的影响,因此,应对表达载体所用的限制性内切酶进行精心选择.现在比较广泛使用的pCOMB系统载体不利于良好性能抗体库的构建.
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大容量人源天然噬菌体抗体文库的建立
随着噬菌体展示技术的发展,抗体库的构建方案日趋成熟,使人们可以从人源噬菌体抗体库中淘选到全人源化的基因工程抗体[1].为抗病毒、抗肿瘤以及自身免疫性疾病等的治疗,开辟了新的途径[2].
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人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的体外成熟
目的提高人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的亲和力和特异性.方法以人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体为基础,通过合成部分随机化的突变引物和PCR等方法构建HCDR3和LCDR3的混合突变库,然后利用噬菌体表面呈现技术对抗体库进行筛选,并利用本实验室建立的单链抗体-碱性磷酸酶系统进行单克隆的鉴定.结果得到4株亲和力和特异性有明显改善的人源化抗体.结论构建CDR3突变库是抗体体外成熟的一个有效方法,该研究为研制低免疫原性的导向溶栓制剂奠定了基础.
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重组抗体在蛋白质组学研究中的应用
人类基因组计划(HGP)的实施将导致对人类基因结构和功能的理解, 即破译人类基因组意味着绘就一张生命之图, 它将为疾病的诊断、新药的研制和新疗法的探索带来革命性的进步, 因此被认为是当代生命科学的一项伟大的科学工程.20世纪末, 人类基因组计划的研究重点是测定人类基因组的全部序列, 目前已接近完成.知道了基因图谱下一步做什么?人们认为: 知道了基因图谱, 还需要经过下面几步, 人类对生命的认识才能有根本性的变革.
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人源抗体研制及应用进展
单克隆抗体(mAb)技术问世已25年,但由于人mAb制备的困难和鼠mAb的异源性,使mAb在人体内治疗方面的应用进展缓慢.近来由于人源化mAb研制的进展及突破,治疗用抗体的开发呈现了强烈的上升势头,在生物高技术领域中成为一个热点.目前mAb市场正以20%速度递增,预计2002年达11亿美元,占重组药物的9%.10年后市场上的治疗性mAb将从现在的几个增加到100个以上,预计销售额超过500亿美元.我国人源治疗性抗体的研制开发尚处于起步阶段,应当有所加强.
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噬菌体抗体库几种筛选方法的比较
目的对多种不同的噬菌体抗体库筛选方法进行比较研究. 方法应用抗原固相化吸附筛选法、生物素化抗原液相筛选法和解离速率筛选法对半合成噬菌体抗体库或轻链替换库进行抗角蛋白噬菌体抗体的筛选,比较各自的筛选效率和优缺点. 结果 3种方法筛选抗角蛋白抗体均获成功,抗原固相化吸附筛选法效果可靠,所获抗体特异性高但抗原消耗量大;生物素化抗原液相筛选法方法敏感且节省抗原,可以根据实验目的和抗体库性质灵活调节筛选体系,其不足是筛选获得的克隆中容易出现非特异性结合的克隆;而解离速率筛选是选择性获得高亲和力抗体的有效手段. 结论不同的筛选策略各具优势,在实际应用中可根据不同的实验目的选择相应的筛选方法.
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小鼠抗人T淋巴细胞表面抗原噬菌体抗体库的构建及筛选
目的构建并筛选小鼠抗人静息/活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示抗体库.方法以人静息/活化T淋巴细胞免疫Balb/c小鼠,取脾细胞,RT-PCR扩增VH和VK基因,拼接为ScFv,插入噬菌粒载体转化大肠杆菌,构建了噬菌体展示抗体库,以人T淋巴细胞为靶抗原,对该库进行了3轮淘洗,ELISA方法鉴定噬菌体抗体.结果成功构建了大实际库容量为1.75×106的小鼠抗人静息T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库和小鼠抗人活化T淋巴细胞表面抗原的噬菌体展示ScFv抗体库.结论所构建的抗体库可进一步用于对T淋巴细胞表面蛋白抗原的差异显示分析及构建基因工程抗体.
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抗体库技术
基因工程抗体可称为第三代抗体,其较前两代抗体有免疫原性低,用途多样等优点.其中抗体库技术又较另两种基因工程抗体(嵌合抗体,改型抗体)优越,可不经免疫制备抗体,又可实现完全人源化,理论上若构建出有足够库容量及多样性的抗体库,便可从中筛选任何抗原的单克隆抗体.该技术有可能取代杂交瘤技术.本文综述了抗体库技术的产生,发展,优点及应用前景等.
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噬菌体抗体库技术研究进展
噬菌体抗体库技术是近10年来发展起来的一项新技术,它的建立是抗体技术领域中的一个革命性进展,使得单克隆抗体的制备得到根本改观.该技术在分子生物学领域和免疫学领域中的应用均有诱人的广阔前景.本文对这一项技术的研究进展作了概括总结.
