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慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR检测方法的建立
参考NCBI(National Center of Biotechnology Information)已发表的慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)的全基因序列,设计3条检测CBPV的特异性引物,建立CBPV半套式PCR(Polymerase Chain Reaetion)检测方法,对其外引物退火温度(52、54、56和58℃)、内引物退火温度(48、50、52和54℃)、引物浓度(0.1、0.2和0.4 mmol/L)和ExTaq酶体积(0.25、0.5和1μL)进行优化,并对优化后的方法进行了特异性、敏感性验证,同时,利用该方法对20份临床样品进行检测.结果表明,该半套式PCR佳外引物退火温度、内引物退火温度、引物浓度和ExTaq酶体积分别为56℃、50℃、0.2 mmol/L和0.25 μL;感染CBPV与健康蜜蜂、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)的cDNA均无交叉反应,检出低下限为10-3pg;从20份临床样品中检出4份阳性.说明建立的CBPV半套式PCR检测方法具有快捷、敏感、特异等优点,可用于CBPV感染的临床诊断和流行病学调查.
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东北部分地区蜱传埃立克体DNA的检测
目的 了解东北部分地区一些蜱种中是否携带埃立克体.方法 应用16S rRNA基因构建的特异性引物进行半套式PCR,检测蜱标本中埃立克体DNA,并对扩增产物进行克隆和序列测定,与基因库中已知序列进行同源性比较.结果 从辽宁清原和吉林抚松、和龙、敦化、珲春的全沟硬蜱(I.persuleatus)和森林革蜱(D.silvarum)中均扩增出了查菲埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库M 73222)相对应片段完全一致,同源性为100%;另外从吉林抚松、珲春的全沟硬蜱中扩增出了粒细胞埃立克体DNA,扩增片段与美国分离株(基因库U 02521)相对应片段相差2个碱基,同源性为99.7%.结论 发现东北部分地区存在埃立克体病的病原学迹象,提示该地区可能存在埃立克体病的自然疫源地.
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半套式PCR检测蜱中查菲埃立克体的评价
我们采用将查菲埃立克体16 S rRNA基因的重组质粒进行稀释的方法,对半套式PCR法检测蜱中查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis,EC)的特异性和敏感性及其在流行病学调查中的应用价值进行了评价,报告如下.
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半套式PCR检测军团菌方法的建立及应用
目的建立检测军团菌的分子生物学方法.方法采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域和嗜肺军团菌巨噬细胞感染增强子(mip)基因编码区域进行扩增,同时采用半套式PCR对常规PCR的扩增结果进行确证.结果采用常规PCR对军团菌属16SrRNA编码区域进行扩增,5种军团菌(包括3种嗜肺军团菌)扩增产物均可见654bp的特异性扩增带,非军团菌菌株PCR结果为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,扩增产物均可见430bp扩增带;同时采用常规PCR对嗜肺军团菌mip基因编码区域进行扩增,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见649bp扩增带,非嗜肺军团菌菌株均为阴性,采用半套式PCR对常规PCR扩增产物进行验证,3种嗜肺军团菌扩增产物均可见399bp扩增带.敏感性为10CFU/ml.并且应用此方法成功检测环境水样中分离的疑似军团菌菌株.结论半套式PCR经济、简便、快速、敏感、特异,为军团菌的早期检测、环境监测、控制暴发流行提供了有效手段.
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布鲁菌病半套式PCR检测方法的建立
目的 建立布鲁菌属半套式PCR检测方法.方法 根据布鲁菌BCSP-31蛋白基因设计三条引物,扩增目的片段长223 bP,通过条件优化,建立了布鲁菌属半套式PCR检测方法.利用所建立的PCR方法对六个种布鲁菌和Y.Center O:9,S.TyPhi,E.Coli O:157进行检测验证其特异性,通过对活菌计数检测验证其敏感性.结果 检测结果表明六个种布鲁菌均可扩出223bP的目的片段,而Y.Center O:9,S.TyPhi和E.Coli O:157不能扩出目的片段.通过对活菌计数低可检测到20个细菌.结论 本研究建立了敏感、特异的布鲁菌病半套式PCR快速检测方法,为布鲁菌的检测和试剂盒的研制奠定了基础.
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前列腺癌患者抗体库构建中抗体基因的扩增
目的:探讨如何扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础.方法:分离前列腺癌患者外周血淋巴细胞,提取其总RNA,逆转录为cDNA,通过改变PCR反应条件扩增出全部κ、λ轻链及大部分重链Fd段;改变PCR反应条件扩增未成功的重链片段改用半套式PCR进行扩增.结果:不仅所有引物都扩增出产物,而且其产量也较高.结论:这表明改变PCR反应条件与半套式PCR联合应用可扩增出种类更多、产量更丰的免疫球蛋白基因,从而增加抗体库的多样性,为抗体库的构建及筛选奠定基础.
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弓形虫PCR检测方法的建立及初步应用
根据弓形虫P30基因序列设计二对引物分别进行了PCR一次扩增和套式扩增,结果这两对引物在一次扩增和套式扩增中分别出现预期的扩增片段914bp、522bp和522bp;套式扩增出现的条带比一次扩增出现的条带亮度明显增强.提示套式扩增比一次扩增具有更高的敏感性.用外引物进行扩增后,低可以检测到1pg的弓形虫DNA.说明所建立的反应体系具有高度的敏感性.用内引物对人工感染弓形虫的ICR小鼠血液、组织进行弓形虫DNA的检测,结果均扩增出522bp的扩增带.根据B1基因序列设计的引物进行PCR一次扩增和半套式扩增.结果均出现预期的扩增片段619bp、362bp和362bp;用半套式扩增检测感染弓形虫的ICR小鼠血液、组织时可扩增出522bp的扩增带,半套式扩增比一次扩增更敏感.
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一种基于momp基因的衣原体分子生物学甄别技术的初步建立
目的利用PCR方法建立一种基于momp基因的衣原体分子甄别方法.方法根据衣原体momp基因的恒定区和可变区分别设计衣原体科特异性引物和种特异性引物,利用PCR方法对本实验室保存的衣原体进行扩增,以达到甄别的目的.利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,研究momp基因的多态性.结果利用建立的PCR方法对本实验室保存的九株衣原体进行了研究,结果表明八株衣原体都是鹦鹉热嗜衣原体,一株为沙眼衣原体.利用限制性片段长度多态性(RFLP)分析科特异性PCR扩增产物,分析了D34、B11001、CW2和CP12四株衣原体,结果可以产生两种不同的带型.结论利用建立的PCR方法可以达到检测甄别衣原体的目的,并可以通过RFLP分析衣原体的侵袭性.
关键词： 衣原体 MOMP基因 半套式PCR 限制性片段长度多态性 -
用半套式PCR检测蜱和啮齿动物中查菲埃立克体
目的了解福建西北部林区查菲埃立克体(Ehrlichia chaffeensis)的存在情况.方法用16S rRNA基因特异引物进行半套式PCR,检测从福建武夷山和宁化采集的蜱类及野生动物中的查菲埃立克体DNA,然后对有代表性的标本的扩增产物进行克隆和序列测定,并与GenBank中注册的核苷酸序列进行同源性比较.结果从该地区的越原血蜱,野鼠(褐家鼠、黄毛鼠、黄胸鼠、社鼠、小家鼠)和野兔的脾脏和/或血块中均扩增出了查菲埃立克体的特异片段.越原血蜱成蜱240组(616只),31组阳性,小阳性率5.0%.野鼠脾脏标本39份,22份阳性.野鼠和野兔血块标本共35份,14份阳性.390bp的PCR产物经克隆、测序后分析发现其DNA序列与美国查菲埃立克体分离株对应位置一致.结论福建西北部林区可能存在人单核细胞埃立克体病的自然疫源地.
